家蠶ZP(zona pellucida)domain基因dusky的克隆、表達與功能研究.pdf

1、ZP是zona pellucida的縮寫，ZP基因是指包含ZP功能域的一群基因。ZP功能域包含約260個氨基酸，其中有8-10個保守的半胱氨酸(Cys)殘基。ZP蛋白大多數(shù)是糖基化的蛋白，其功能多種多樣，從精子受體到結(jié)構(gòu)原件的動力傳導器，從卵殼的主要成分到參與信號傳導，以及哺乳動物和非哺乳動物的各種受體。ZP功能域的突變會引起蛋白質(zhì)功能的缺失以及很多的疾病。因此，許多ZP蛋白都引起了人們的高度關(guān)注，因為它們在特定組織大量表達，并且和很多

2、人類疾病相關(guān)。 翅的發(fā)生使昆蟲在覓食、尋偶、擴大分布和避敵等多方面獲得了優(yōu)越的競爭能力，是昆蟲綱成為最繁榮的生物類群的重要原因。家蠶作為鱗翅目昆蟲的模式代表，又是目前完成基因組測序的唯一的一種鱗翅目昆蟲，其ZP基因，尤其是在翅中的研究還未見相關(guān)報道。本研究在家蠶基因組中鑒定出了一群ZP基因，并對它們進行了生物信息學分析。同時為了研究ZP基因在家蠶翅中的作用，克隆了其中一個dusky基因，對其在家蠶不同發(fā)育時期的表達進行了檢測，并

3、采用RNAi技術(shù)對其功能進行了初步研究，獲得結(jié)果如下： 1、家蠶ZP基因家族的生物信息學分析 已報道在果蠅中有16個ZP基因，其中部分基因的功能在果蠅中有相關(guān)的研究。通過同源檢索，我們發(fā)現(xiàn)這16個基因在家蠶基因組中均存在同源基因。其中部分基因的功能在果蠅中有相關(guān)的研究。通過分析家蠶ZP基因的結(jié)構(gòu)域特點發(fā)現(xiàn)其和果蠅ZP基因的結(jié)構(gòu)域非常相似。通過進化分析還發(fā)現(xiàn)它們的進化關(guān)系也比較對應。這一結(jié)果表明，ZP基因在鱗翅目和雙翅目昆

4、蟲中還是比較保守的。另外，還基于家蠶基因組數(shù)據(jù)對家蠶ZP基因在染色體上的位置特點進行了分析，通過芯片數(shù)據(jù)對其表達特點進行了分析。 2、家蠶dusky基因的克隆及序列分析 在對家蠶基因組數(shù)據(jù)進行生物信息學分析的基礎上，設計引物克隆了家蠶dusky基因的全長CDS序列。結(jié)果表明，家蠶dusky基因是單外顯子基因，ORF長1398bp，編碼465個氨基酸。物種間同源蛋白質(zhì)序列的比對結(jié)果表明，家蠶同其他不同物種間的dusky基因

5、的ZP domain序列保守，且都能找到10個半胱氦酸殘基。 3、家蠶dusky基因的mRNA表達模式 家蠶dusky基因在在家蠶不同組織中的表達檢測結(jié)果表明，其基因在家蠶5齡第6天幼蟲的頭部、體壁、卵巢、精巢、馬氏管、絲腺、血液、脂肪體和中腸中都沒有表達，而在翅原基中卻有大量表達，這一結(jié)果說明dusky基因在家蠶翅發(fā)育過程中特異表達，推測dusky基因?qū)倚Q翅的發(fā)育有重要作用。家蠶dusky基因在在家蠶翅發(fā)育中的表達檢

6、測結(jié)果說明，dusky基因在幼蟲和蛹前期的家蠶翅中都有表達，而在蛹后期和化蛾后沒有表達。 4、家蠶dusky基因在翅發(fā)育中的RNAi研究 本實驗對dusky基因在家蠶翅中進行了RNAi干涉實驗，結(jié)果表明，家蠶dusky基因被干涉后，翅表現(xiàn)為小翅的表型。同時，對干涉后翅的毛孔進行的掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，毛孔有變密的趨勢。最后，通過定量PCR的方法對干涉后dusty基因的表達作了分子水平的檢測，結(jié)果表明dusky基因被干涉后表達