視黃醇對脂多糖誘導(dǎo)的大鼠乳腺炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)及機(jī)制研究.pdf

1、本實(shí)驗(yàn)選用健康SD大鼠,利用LPS誘發(fā)試驗(yàn)性大鼠乳腺炎模型,研究多功能營養(yǎng)素視黃醇對大鼠乳腺防御機(jī)能的影響和保護(hù)作用；并建立原代培養(yǎng)的大鼠乳腺上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)模型,進(jìn)一步在體外研究了視黃醇對大鼠乳腺上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)機(jī)制。
　　 1.視黃醇對試驗(yàn)性乳腺炎大鼠的保護(hù)作用研究
　　 為研究視黃醇對LPS誘發(fā)的試驗(yàn)性乳腺炎大鼠的保護(hù)作用,40只清潔級SD孕鼠隨機(jī)分為正常對照組(NC,n=8)、陽性對照組(PC,n=8)和試

2、驗(yàn)組(T,n=24)。自懷孕第十天起,試驗(yàn)組分別灌胃視黃醇(溶解于大豆油)4000 I.U/kg·d(L,n=8)、8000 I.U/kg·d(M,n=8)、16000 I.U/kg·d(H,n=8),對照組灌胃等量的大豆油,連續(xù)灌胃十天。產(chǎn)后72 h分別灌注滅菌生理鹽水和10μg/側(cè)LPS到大鼠第四對乳腺(兩側(cè))內(nèi),12 h處死大鼠,收集血清及乳腺組織樣品。LPS灌注乳腺12 h后,乳腺組織中髓過氧化物酶(myeloperoxidas

3、e,MPO)、N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(N-acetyl-β-D-glucosaminidase,NAGase)活性,腫瘤壞死因子-α(tumor necrosisfactor-α,TNF-α)、白細(xì)胞介素-8(interleukin-8,IL-8)均顯著升高,血清中MPO、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性、總抗氧化能力(total anti-oxidizingcapability,T-AO

4、C)及乳腺組織中白細(xì)胞介素-2(interleukin-2,IL-2)水平顯著降低。與陽性對照組相比,灌胃視黃醇顯著降低乳腺組織中MPO、NAGase的活性及TNF-α水平,顯著提高血清中IL-2水平；低、中劑量視黃醇能降低中性粒細(xì)胞(neutrophil,PMN)在乳腺組織中的浸潤,提高血清SOD活性及T-AOC,改善因LPS引起的外周血T淋巴細(xì)胞CD4+與CD8+比值的失衡.結(jié)果證實(shí)視黃醇對LPS誘發(fā)的試驗(yàn)性乳腺炎大鼠有一定的保護(hù)作

5、用。
　　 2.視黃醇對試驗(yàn)性乳腺炎大鼠炎性細(xì)胞因子釋放的影響
　　 為探討視黃醇對試驗(yàn)性乳腺炎大鼠炎性細(xì)胞因子釋放的調(diào)節(jié)作用機(jī)制,72只清潔級SD懷孕大鼠被隨機(jī)分成對照組(C,n=36)和試驗(yàn)組(T,n=36)。懷孕第十天起,每天灌胃視黃醇8000 I.U/kg·d(溶解于大豆油),連續(xù)灌胃十天；對照組灌胃等體積的大豆油。產(chǎn)后72 h經(jīng)乳頭管灌注LPS10μg/側(cè)到第四對乳腺(兩側(cè))內(nèi),分別于灌注前(定義為0 h)及灌

6、注后2、4、8、16和24 h(n=6)頸靜脈放血處死動物,采集樣品。試驗(yàn)結(jié)果顯示,視黃醇處理顯著降低了LPS灌注后乳腺組織中Toll樣受體-4(toll-likereceptor-4,TLR-4)、核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)p65 mRNA表達(dá),顯著抑制NF-κB與DNA的結(jié)合活性,顯著降低乳腺組織中TNF-α與白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)的釋放。結(jié)果表明,灌胃視

7、黃醇通過降低TLR-4 mRNA的表達(dá),抑制NF-κB p65 mRNA表達(dá)及NF-κB與DNA的結(jié)合活性,抑制其下游相關(guān)炎癥因子TNF-α及IL-1β的過度釋放,減輕炎癥因子對乳腺組織的損傷。
　　 3.視黃醇對試驗(yàn)性乳腺炎大鼠中性粒細(xì)胞活性的影響
　　 為探討視黃醇對試驗(yàn)性乳腺炎大鼠中性粒細(xì)胞活性的影響,72只清潔級SD懷孕大鼠被隨機(jī)分為對照組(C,n=36)和試驗(yàn)組(T,n=36).懷孕第十天起,每天灌胃視黃醇80

8、00 I.U/kg·d(溶解于大豆油),連續(xù)灌胃十天；對照組灌胃等體積的大豆油。產(chǎn)后72 h經(jīng)乳頭管灌注LPS10μg/側(cè)到第四對乳腺(兩側(cè))內(nèi)。分別于灌注前(定義為0 h)及灌注后2、4、8、16和24 h(n=6)頸靜脈放血處死動物,采集樣品。MPO活力及組織病理學(xué)觀察顯示,視黃醇加快了LPS誘發(fā)炎癥的組織修復(fù)進(jìn)程,降低PMN在組織中的積聚與持續(xù)激活,顯著降低LPS灌注后IL-8的釋放,降低乳腺組織與血清中NAGose活力,促進(jìn)細(xì)胞

9、間粘附分子-1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)的優(yōu)先表達(dá),降低外周血PMN活性氧的釋放。試驗(yàn)結(jié)果表明,灌胃視黃醇能調(diào)節(jié)PMN活性,加快PMN的動態(tài)遷徙,降低其活性氧的過度釋放,對PMN引起的氧化應(yīng)激具有一定的保護(hù)作用。
　　 4.大鼠乳腺上皮細(xì)胞的優(yōu)化培養(yǎng)及其炎癥反應(yīng)模型的建立
　　 乳腺上皮細(xì)胞是乳腺組織的功能細(xì)胞,在受到病原微生物刺激時(shí),乳腺上皮細(xì)胞也可產(chǎn)生“自主”

10、抵抗。本研究旨在優(yōu)化大鼠乳腺上皮細(xì)胞培養(yǎng)體系,并建立其炎癥反應(yīng)模型,為進(jìn)一步深入研究動物乳腺防御機(jī)制奠定基礎(chǔ)。選擇妊娠15-18天的健康SD大鼠,無菌采集乳腺組織,分離大鼠乳腺上皮細(xì)胞。結(jié)果表明通過膠原酶和透明質(zhì)酸酶聯(lián)合消化能成功分離大鼠乳腺上皮細(xì)胞,并且在添加了胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、表皮生長因子、氫化可的松等營養(yǎng)因子的DMEM/F12培養(yǎng)液中生長情況良好。對角蛋白及β-酪蛋白的鑒定結(jié)果表明,通過此法分離培養(yǎng)的大鼠乳腺上皮細(xì)胞純度在95％以

11、上,并具備較好的生物學(xué)功能.LPS刺激細(xì)胞24 h,TNF-α、IL-1β及誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)mRNA表達(dá)均極顯著升高,并且LPS刺激濃度在1-10μg/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)劑量依賴效應(yīng),由于細(xì)胞毒性的作用20μg/mL LPS處理時(shí)上述細(xì)胞因子的表達(dá)有輕微下降,但仍顯著高于對照組。10μg/mL LPS刺激顯著提高TNF-α、IL-1β、一氧化氮(nitric ox

12、ide,NO)的釋放。結(jié)果表明,本試驗(yàn)成功建立了大鼠乳腺上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)體系及其炎癥反應(yīng)模型。
　　 5.視黃醇對試驗(yàn)性誘發(fā)的大鼠乳腺上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)及機(jī)制研究
　　 為進(jìn)一步研究視黃醇對原代培養(yǎng)的大鼠乳腺上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)及機(jī)制,分離并原代培養(yǎng)大鼠乳腺上皮細(xì)胞,待細(xì)胞鋪滿整個培養(yǎng)瓶的90％,分為對照組和試驗(yàn)組,試驗(yàn)組于基礎(chǔ)培養(yǎng)液中添加1μmol/L視黃醇(溶解于DMSO),對照組于基礎(chǔ)培養(yǎng)液中添加等量的DMS

13、O,處理24 h后更換培養(yǎng)液,用10μg/mL的LPS處理細(xì)胞,分別于不同時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞。LPS能顯著上調(diào)大鼠乳腺上皮細(xì)胞TLR-4蛋白水平及NF-κB與DNA的結(jié)合活性,而視黃醇處理能顯著降低LPS處理后TLR-4蛋白水平,極顯著降低NF-κB與DNA的結(jié)合活性。LPS處理大鼠乳腺上皮細(xì)胞后引起各個時(shí)間點(diǎn)炎性因子TNF—α、IL-1β、中性粒細(xì)胞趨化因子-1(cytokine-induced neutrophilchemoattrac

14、tant-1,CINC-1)、iNOS、ICAM-1 mRNA表達(dá)極顯著的升高,視黃醇能顯著下調(diào)2、4、8、12 h TNF—α mRNA表達(dá),2、4、8 h IL-1β mRNA表達(dá)及8、12 h iNOS、ICAM-1 mRNA表達(dá),而對CINC-1 mRNA表達(dá)無顯著影響。試驗(yàn)結(jié)果表明,視黃醇預(yù)處理通過下調(diào)TLR-4/NF-κB信號途徑減輕LPS介導(dǎo)的大鼠乳腺上皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。
　　 綜上所述,視黃醇能增強(qiáng)大鼠乳腺防御機(jī)