細(xì)菌dna提取方法

1、細(xì)菌dna提取方案第1頁共4頁細(xì)菌細(xì)菌DNA提取方案提取方案細(xì)菌DNA提取方案：革蘭氏陰性菌，如E.coli，一般有三種可以選擇的方法。一、水煮模板法一、水煮模板法——主要用于主要用于PCR反應(yīng)反應(yīng)1、接種單菌落于LB或腦心平板，連續(xù)畫線，37攝氏度培養(yǎng)18－24小時(shí)。2、刮取1～2接種環(huán)菌苔加入150微升三蒸水中，混勻，100攝氏度煮沸10分鐘。3、12000轉(zhuǎn)分鐘離心10分鐘，取上清，－20攝氏度保存?zhèn)溆?。操作最簡便，對試劑條件要求

2、低。缺點(diǎn)是純度不夠高，可能會含有RNA、蛋白蛋白等雜質(zhì)。但是作為一般檢測檢測目的的PCR反應(yīng)模板已經(jīng)足夠了。有人稱擴(kuò)增4kb以下片段都可用此種方法制取模版，編者用此類模板PCR可以擴(kuò)增到3500bp的片段。編者建議：此法得到的模版保存時(shí)間短，強(qiáng)烈建議每月重新制作一次。二、二、CTABNaCl法1、接種一單菌落于5mlLB中30℃培養(yǎng)過夜2、取1ml種子培養(yǎng)液接入100ml2%LB中37℃、220rmin培養(yǎng)16小時(shí)3、5000rmin離

3、心10分鐘棄去上清。4、加入10mlTE離心洗滌后用10mlTE溶解菌體混勻20℃保存?zhèn)溆谩?、取3.5ml菌懸液加入184μl10%SDS混勻加入37μl10mgml蛋白酶K混勻37℃溫育1小時(shí)6、加入740μl5molLNaCl再加入512μlCTABNaCl混勻65℃溫育10分鐘。7、加入等體積的氯仿異戊醇混勻10000rmin離心5分鐘保留上清。8、上清中加入等體積的酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)混勻10000rmin離心5

4、分鐘保留上清。9、加入0.6倍的異丙醇混勻10000rmin離心5分鐘收集DNA沉淀用70%乙醇離心洗滌DNA沉淀。10、用1mlTE溶解DNA加入終濃度為20μgmlRNaseA4℃保存。CTABNaCl法提取的DNA純度較高，蛋白雜質(zhì)較少，保存時(shí)間長，編者更喜歡把終濃度為20μgmlRnaseA加在第5步溫育的時(shí)候，這樣最后沒有RnaseA污染。每一步操作細(xì)致一些，得到的DNA可用于Southern細(xì)菌dna提取方案第3頁共4頁C.

5、然后加入200ul5molL的氯化鈉溶液，混勻后于13000rpm離心15min。D.取上清液，用苯酚抽提2次，氯仿抽提1次。E.加兩倍體積無水乙醇，110體積醋酸鉀(3MpH8.0)，20度保存1小時(shí)后，13000rpm離心15min，棄上清液，沉淀用70%乙醇洗2次；置于室溫干燥后，溶于50ulTE溶液中，置4℃保存?zhèn)溆谩?蛋白酶SDS法制備先用10ml含適當(dāng)抗生素的GBM過夜培養(yǎng)Delftiasp.，第二天4000rpm離心10m

6、in收集菌體，用WashingTE（50mmolLTrisHClpH8.010mmolLEDTApH8.0）洗菌體2次，之后將菌體充分懸浮在5ml1TE緩沖液中，先后加入0.5ml5mgL的蛋白酶、0.5ml10%SDS，輕輕混勻后50℃放置3h~5h，接著用等體積的Tris飽和苯酚抽提2次，苯酚氯仿異戊醇抽提一次，氯仿抽提一次后，乙醇沉淀DNA，用自動移液器吸管頭將絮狀DNA沉淀塊吸附到Ep管中，70%乙醇洗2次，干燥后溶于適當(dāng)1TE

7、或ddH2O中。31)細(xì)菌培養(yǎng)：細(xì)菌接種于5ml液體培養(yǎng)基中，37℃搖床（300rpm）培養(yǎng)過液。2)細(xì)菌收集：取1ml培養(yǎng)物于1.5mlEP管中，室溫8000rpm離心5min，棄上清，沉淀重新懸浮于1mlTE（pH8.0）中（用ddH2O也行)。3)菌體裂解：加入6μl50mgml的溶菌酶，37℃作用2h。再加2molLNaCl50μl，10%SDS110μl，20mgml的蛋白酶K3μl，50℃作用3h或37℃過夜。（此時(shí)菌液應(yīng)為

8、透明粘稠液體）4)抽提：菌液均分到兩個(gè)1.5mlEP管，加等體積的酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)，混勻，室溫放置510min。12000rpm離心10min。抽提兩次。（上清很粘稠，吸取時(shí)應(yīng)小心，最好槍頭尖應(yīng)剪去）5)沉淀：加0.6倍體積的異丙醇，混勻，室溫放置10min。12000rpm離心10min。6)洗滌：沉淀用75%的乙醇洗滌。7)抽（涼）干后，溶于50μlddH2O中，取25μl電泳。作PCR模板用。4.DNAEXTRA

9、CTIONPROCEDUREGENERAL1)Growcellsovernightin500mlbrothmedium.2)Pelletcellsbycentrifugationresuspendin5ml50mMTris(pH8.0)50mMEDTA.3)Freezecellsuspensionat20C4)Add0.5ml250mMTris(pH8.0)10mgmllysozymetofrozensuspensionletthawa

10、troomtemperature.Whenthawedplaceonicef45min.5)Add1ml0.5%SDS50mMTris(pH7.5)0.4MEDTA1mgmlproteinaseK.Placein50Cwaterbathf60min.6)Extractwith6mlTrisequilibratedphenolcentrifugeat10000Xgf15min.Transfertoplayertonewtube(avoid

11、interface).Redothisstepifnecessary.7)Add0.1vol3MNaacetate(mixgently)thenadd2vol95%ethanol(mixbyinverting).SpooloutDNAtransferto5ml50mMTris(pH7.5)1mMEDTA200gmlRNase.Dissolveovernightbyrockingat4C.8)Extractwithequalvolumec

12、hlofm(mixbyinverting)centrifugeat10000Xgf5min.Transfertoplayertoanewtube.9)Add0.1vol3MNaacetate(mixgently)thenadd2vol95%ethanol(mixbyinverting).10)SpooloutDNAdissolvein2ml50mMTris(pH7.5)1mMEDTA.11)CheckpurityofDNAbyelect

13、rophesisspectrophotometricanalysis.51)100ml細(xì)菌過夜培養(yǎng)液5000rpm離心10分鐘去上清液。2)加9.5mlTE懸浮沉淀并加0.5ml10%SDS50μl20mgml(或1mg干粉)蛋白酶K混勻37℃保溫1小時(shí)。3)加1.5ml5molLNaCl混勻。4)加1.5mlCTABNaCl溶液混勻65℃保溫20分鐘。5)用等體積酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)抽提5000rpm離心10分鐘將上清液

14、移至干凈離心管。6)用等體積氯仿:異戊醇(24:1)抽提取上清液移至干凈管中。7)加1倍體積異丙醇顛倒混合室溫下靜止10分鐘，沉淀DNA。8)用玻棒撈出DNA沉淀70%乙醇漂洗后吸干溶解于1mlTE20℃保存。如DNA沉淀無法撈出可5000rpm離心使DNA沉淀。9)如要除去其中的RNA可以按本章第三節(jié)中操作步驟處理。注：1)CTABNaCl溶液：4.1gNaCl溶解于80mlH2O緩慢加入10gCTAB加水至100ml。2)氯仿:異戊

15、醇(24:1)，酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)，異丙醇，70%乙醇，TE，10%SDS，蛋白酶K(20mgml或粉劑)，5molLNaCl。本方法通過SDS裂解細(xì)胞，蛋白酶降解蛋白，CTAB去除多糖成分一：儀器：同方法一二：試劑：TE、TAE緩沖液；10%SDS；５ＭNaCL；20mgml蛋白酶Ｋ；CTABNaCL溶液(10%CTAB，0.7MNaCL4.1gNaCL溶于80ml水中，緩慢加入10gCTAB，加熱溶解)；25241酚