囊絲黃精polygonatumcyrtonemahua.離體再生體系的建立和活性成分分析、黃精凝集素ⅱ基團特異性化學(xué)修飾與生物學(xué)活性及其基因的克隆與表達研究

1、四川大學(xué)博士學(xué)位論文囊絲黃精（Polygonatum cyrtonema Hua.）離體再生體系的建立和活性成分分析、黃精凝集素Ⅱ基團特異性化學(xué)修飾與生物學(xué)活性及其基因的克隆與表達研究姓名：鮑錦庫申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：植物學(xué)指導(dǎo)教師：陳放20031101四川大學(xué)博士學(xué)位論文賴氨酸( L y s ) 的e - N H 2 修飾導(dǎo)致凝集素的凝血活性和促淋巴細(xì)胞有絲分裂活性下降，表明L y s 的．N H 2 參與活性中心結(jié)構(gòu)域，光譜研究顯

2、示P C L I I 結(jié)構(gòu)僅發(fā)生細(xì)微變化。組氨酸( H i s ) 的咪唑基修飾導(dǎo)致黃精凝集素I I 僅保留5 0 ％的血凝活性，其它活性基本保持不變，光譜監(jiān)測分析表明P C L I I 主要集中在側(cè)鏈基團微環(huán)境的變化，主鏈構(gòu)象變化極其微小。說明H i s 為血凝活性中心重要的決定性殘基，在其中扮演著重要的角色。采用不同的方法對酪氨酸( 聊) 進行了修飾：用即酚羥基專一性試劑對硝基苯磺酰氟( N B S F ) 修飾P C L1 1 ，

3、導(dǎo)致P C L I I 促淋巴細(xì)胞有絲分裂活性大幅下降，表明研的酚羥基對于此活性是必需的。用N ．乙酰咪唑( N A I ) 修飾酚羥基亦得出相同的結(jié)果，但促淋巴細(xì)胞分裂活性下降更甚，此應(yīng)歸因于即廣泛乙?；那闆r下，L y s 的- N H z 的乙?；瘜Υ嘶钚杂兴绊憣?dǎo)致。熒光光譜分析表明，N B S F 修飾對P C L I I 結(jié)構(gòu)影響不大，但N A I 的修飾可引起P C L I I 結(jié)構(gòu)有較大程度的松散。由此可以得出結(jié)論，T

4、y r 的酚羥基作為必需基團參與了促淋巴細(xì)胞有絲分裂活性中的構(gòu)成。P C L l l 分子中的血凝活性中心和促淋巴細(xì)胞有絲分裂活性中心是相互獨立的。用專一性試劑對天冬氨酸／谷氨酸進行修飾，導(dǎo)致P C L I t 血凝活性幾乎完全喪失，說明酸性氨基酸的羧基對P C L I I 的凝集血細(xì)胞活性是非常重要的，可能直接參與活性中心的組成或位于附近。同時促淋巴細(xì)胞分裂活性亦有一定程度的下降。進一步證實P C L l l 分子中存在多個相互獨立的

5、活性中心結(jié)構(gòu)域，分別行使不同的生物學(xué)活性。用三種淬滅劑C s C l 、K I 、丙烯酰胺對P C L I I 進行的淬滅研究表明它們對蛋白質(zhì)分子的淬滅都是動態(tài)淬滅機制。綜合三種淬滅劑對黃精凝集素I I 的淬滅效果，黃精凝集素I I 中T y r 和T r p 對中性淬滅劑( 丙烯酰胺) 的可接近程度分別達到8 8 ．5 ％和7 4 ．0 7 ％，面對陰離子淬滅劑( K I ) 為5 5 ．5 ％和6 6 ．6 ％，對陽離子淬滅劑( C

6、 s C l ) 只有2 5 ％。說明黃精凝集素I I 中部分發(fā)射熒光的氨基酸殘基在疏水內(nèi)核中，且所有發(fā)熒光氨基酸帶負(fù)電荷的比例比帶正電荷的比例大近一倍。黃精凝集素I I 中T r p 殘基大部分是位于黃精凝集素1 1 分子表面，小部分埋藏于分子內(nèi)部疏水性環(huán)境中。采用細(xì)胞病變效應(yīng)法( C P E 法) 和細(xì)胞代謝法( M T T 法) ，研究黃精凝集素I I 對人類單純皰疹病毒( H S V - I I ) 的抑制作用，結(jié)果表明黃精凝集