體內(nèi)藥物分析方法介紹

1、體內(nèi)藥物分析體內(nèi)藥物分析是通過分析的手段了解藥物在體內(nèi)（包括實驗動物等機體）數(shù)量與質(zhì)量的變化，獲得各種藥物代謝動力學(xué)的各種參數(shù)和轉(zhuǎn)變、代謝的方式、途徑等信息。從而有助于藥物生產(chǎn)、實驗、研究、臨床等各個方面對所研究的藥物作出估計與評價，以及對藥物的改進和發(fā)展作出貢獻。 體內(nèi)藥物分析任務(wù)和對象的特點：1、被測定的藥物和代謝物的濃度或活性極低；2、樣品中存在各種直接或間接影響測定結(jié)果的物質(zhì)，大多需要分離和凈化；3、樣品量少，尤其是連續(xù)測定時，

2、很難再度獲得完全相同的樣品；4、工作量較大，隨著工作的深入開展，會成倍地甚或按指數(shù)級數(shù)增加；5、往往要求很快地提供結(jié)果，尤其在毒物檢測工作中；6、實驗室應(yīng)有多種檢測手段，可進行多項分析工作；7、測定數(shù)據(jù)的處理和闡明有時不太容易。 樣品的種類、采集和儲存一、樣品的種類和選取原則：（一）血樣：血漿(plasma)和血清(serum)是體內(nèi)藥物分析最常采用的樣本，其中選用最多的是血漿。因血漿中的藥濃可反映藥物在體內(nèi)（靶器管）的狀況。而且血漿中

3、藥物濃度的數(shù)據(jù)報道較多，可供借鑒。血漿是全血(whole blood)在加肝素、枸櫞酸、草酸鹽等抗凝劑的全血經(jīng)離心后分取，量約為全血的一半。血清則是在血液中纖維蛋白元等影響下，引起析出血塊，離心取得。血塊凝結(jié)時往往易造成藥物吸附損失。全血也應(yīng)加入抗凝劑混勻，以防凝血。對大多數(shù)藥物來說血漿濃度與紅細(xì)胞中的濃度成正比，所以測定全血也不能提供更多的數(shù)據(jù)，而全血的凈化較血漿與血清麻煩，尤其是溶血后，血色素等可能會給測定帶來影響。但是一些可與紅血

4、球結(jié)合或藥物在血漿和血球的分配比率因不同病人而異的情況下，則宜采用全血。血樣采取量會受到一定的限制，血樣取樣時間間隔問題也常隨測定目的不同而異。目前大都是測定原型藥物總量。當(dāng)藥物與血清蛋白結(jié)合率穩(wěn)定時，血藥總濃度可以有效表示游離藥物的濃度。但對低蛋白癥或尿毒癥患者，藥物結(jié)合率降低，則在通常安全有效的血藥總濃度中，游離型藥物濃度可顯著增加。（二）尿樣(urine)：尿樣測定主要用于藥物劑量回收研究、藥物腎清除率和生物利用度等研究，以及測定

5、代謝物類型等。體內(nèi)藥物清除主要是通過尿液排出，藥物可以原型（母體藥物）或代謝物及其綴合物形式排出。尿液藥物濃度較高，收集量可以很大，但尿液濃度通常變化較大，所以宜測定一定時間內(nèi)尿中藥物的總量（如 8、12、24 小時內(nèi)的累計量） ，需記錄排出尿液體積及尿藥濃度。尿藥濃度改變不直接反映血藥濃度，受試者腎功能將影響藥物的排泄。尿中藥物大多呈綴合狀態(tài)，測定前要將綴合的藥物游離。此外，采集尿液不可能在較短時間內(nèi)多次取樣，排尿時間較難掌握（尤其是

6、嬰兒） ，同時也具有不易采集完全的缺點。（三）唾液(saliva)：唾液中的藥物濃度通常與血漿濃度相關(guān)。樣品易得，取樣無損害，尤易為兒童接收。有些可從藥物唾液濃度推定血漿中游離藥物濃度。但有些蛋白結(jié)合率較高的藥物在唾液中的濃度比血漿濃度低得多，需高靈敏度的方法才能檢測。唾液 pH 值6.9±0.5，每日分泌量 1～1.5L，含有的主要電解質(zhì)有 Na+、K+、Cl-、HCO3-等，主要有機成分是粘液質(zhì)和淀粉酶。采樣一般是在漱口后

7、 15 分鐘，收集口內(nèi)自然流出或經(jīng)舌在口內(nèi)攪動后流出的混合唾液（吸管內(nèi)吸附的少量唾液用稀釋液洗出） ，用 2000～3000rpm 離心 15分鐘，小心吸取上清液，進一步分離、凈化。也可采用物理（嚼石蠟片、小塊聚四氟乙烯情況下將試管平置于振蕩器內(nèi)振蕩，振蕩時間與強度視情況而定?？刹捎靡浴八幬镛D(zhuǎn)入溶劑中量”與“混合時間”作圖法，選取理想和符合實際的提取方式和時間。（四）提取溶劑的蒸發(fā)：提取液常為數(shù) ml，往往不能直接供 GC 或 HPLC

8、 測定，需采取濃集辦法，常用真空蒸發(fā)（注意暴沸）或吹氮氣流使溶劑揮散。四、固相分離：以固相分離方法進行樣品預(yù)處理，從水相中分離出所需測定的組份，通常以柱分離方式進行操作，故有時這種方法又稱為固相提取柱(Solid-phase extraction column)法。這類柱分兩類：一種是阻留全部樣品在柱上；一種則僅阻留藥物及其相關(guān)物質(zhì)。常用于填充柱的固相分離物質(zhì)有氧化鋁、活性碳、硅藻土、離子交換樹脂及非離子型的樹脂及凝膠等。在第一類柱中，

9、常使用親水性裝填物，如硅藻土，可捕集全部樣品。樣品全部吸附在固相顆粒表面，形成一薄層，即使樣品中含水也能如此。采用一種與水不相混溶的有機溶劑如氯乙烷傾入柱中，即可洗提藥物。第二類柱則較有選擇性，可裝填疏水物或離子交換樹脂，對藥物及其相關(guān)物質(zhì)進行滯留。常用的疏水物有活性碳、聚苯乙烯或 C18 化學(xué)鍵合硅膠。這種疏水柱可從樣品中吸附親脂性藥物，然后用有機溶劑將藥物洗提分離。離子交換柱適用于高極性、可電離的藥物。五、利用分子大小進行分離—供血

10、漿中游離藥物的測定：采用超速離心、平衡透析、限外過濾（超濾）以及凝膠過濾方法等。以上方法也可用于藥物蛋白結(jié)合率的測定。六、導(dǎo)致待測物損失的因素：（一）吸附：玻璃表面或橡膠塞會吸附藥物，特別是脂肪胺類及含硫化合物?？刹捎霉柰榛瘻p少玻璃表面的吸附性，非極性提取溶劑中加入少量極性溶劑可減少器皿對藥物的吸附。 血樣中紅血球和纖維蛋白元凝塊的形成，常能引起待測物的共沉淀。所以宜將全血樣品加入緩沖液后再行提取。這樣血球散開，藥物可從血球表面解

11、吸，以減少共沉淀的損失。緩沖液的一定離子強度，可蛋白質(zhì)變性時形成疏松的絮狀物，這樣可減少藥物的物理性滯留和共沉淀的損失。（二）化學(xué)降解：藥物的化學(xué)和生物學(xué)不穩(wěn)定性常引起化學(xué)分解；光化學(xué)及熱穩(wěn)定性（尤其在凈化步驟中強酸、強堿的中和所產(chǎn)生的熱）引起的損失，也應(yīng)加注意。應(yīng)盡量采用溫和條件制備樣品，經(jīng)免引起藥物的部分分解、開環(huán)等情況發(fā)生，有的藥物尚需避光操作。（三）衍生化反應(yīng)：由于不完全反應(yīng)，待測藥物僅部分轉(zhuǎn)化為所需的產(chǎn)物或形成副產(chǎn)物。有時在蒸

12、發(fā)除去過量衍生化試劑時，使得衍生物與溶劑形成共沸混合物而導(dǎo)致?lián)p失。（四）絡(luò)合：某些藥物會與重金屬離子絡(luò)合或與內(nèi)源必性大分子相互作用，這種情況雖較少遇到，但往往是某些樣品制備中藥物損失的一個因素。（五）蒸發(fā)：有的是藥物本身的揮發(fā)性（如苯丙胺）或因蒸發(fā)所得殘渣未能完全溶于所加的小體積溶劑中；或因減壓濃縮引起溶液暴沸而導(dǎo)致?lián)p失；或在吹氮過程中使藥物以氣溶膠形式逸出。七、樣品沾污：（一）增塑劑(Plasticizers)：測定發(fā)現(xiàn)某些塑料血樣采

13、集管含有 3-(2-丁羥乙基)磷酸酯等，可使溶劑提取步驟中藥物分配系數(shù)變化、方法變異系數(shù)增大（從 5%增至20%） 。（二）脂肪酸及酯類：血樣中濃度約為 350μg/ml（10-3mol/L） ，較待測藥物高 102～103 倍以上,易被提入。常出現(xiàn)在色譜圖中。（三）溶劑中雜質(zhì)：由于溶劑體積其它試劑為大，即使原來雜質(zhì)濃度較低，濃集時或通過色譜柱時，濃度顯著增大而干擾測定。更嚴(yán)重的是干擾物在每批溶劑或試劑中有所不同，而影響不同實驗室間、各