超高壓致大腸桿菌O157-H7損傷機制的研究.pdf

1、超高壓技術(shù)作為一種非熱殺菌技術(shù)，已成為控制食品中大腸桿菌O157∶H7的有效手段。然而，超高壓處理后可誘導(dǎo)細菌產(chǎn)生損傷，因其菌體特性改變以至于在常規(guī)檢測中常被低估或忽略，對食品安全性及貨架期造成極大隱患。目前超高壓誘導(dǎo)大腸桿菌O157∶H7損傷機制尚缺乏系統(tǒng)深入的研究，應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)方法研究超高壓誘導(dǎo)大腸桿菌O157∶H7損傷機制尚少見報道，而同一種菌不同菌株之間耐壓性存在差異，因此，本研究以耐壓性較強的大腸桿菌O157∶H7 CICC

2、21530為研究對象，采用不同壓強進行超高壓處理，分別應(yīng)用傳統(tǒng)培養(yǎng)計數(shù)方法和流式細胞術(shù)檢測損傷情況，進一步分析超高壓對大腸桿菌O157∶H7的形態(tài)結(jié)構(gòu)及生理特征的影響，并著重應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)方法進行差異表達蛋白的功能分析和代謝通路分析，以探討損傷機制，為實際生產(chǎn)加工中應(yīng)用超高壓有效控制大腸桿菌O157∶H7提供科學(xué)依據(jù)。具體研究內(nèi)容和結(jié)果如下:
　　1、超高壓處理后大腸桿菌O157∶H7損傷的檢測
　　大腸桿菌O157∶H7分

3、別采用200 MPa、400 MPa、500 MPa(25℃，5 min)進行超高壓處理，分別應(yīng)用流式細胞術(shù)和傳統(tǒng)培養(yǎng)計數(shù)方法檢測細菌損傷情況。傳統(tǒng)培養(yǎng)計數(shù)結(jié)果表明，隨著壓強升高，滅活效應(yīng)越強，但損傷效應(yīng)與致死效應(yīng)并不一致，在400 MPa時損傷菌最多。流式細胞術(shù)結(jié)果表明，細胞膜是超高壓的主要作用位點之一，隨著壓強升高，菌體膜損傷越嚴重，而對胞內(nèi)酯酶無明顯影響。與傳統(tǒng)平板計數(shù)方法相比，流式細胞術(shù)檢測到的正常菌顯著高于傳統(tǒng)平板計數(shù)法，表明

4、流式細胞術(shù)能夠更好地檢測實驗結(jié)果，獲得更多實驗信息，從而能夠更加全面反映超高壓處理對大腸桿菌O157∶H7的損傷情況。
　　2、超高壓對大腸桿菌O157∶H7形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響
　　大腸桿菌O157∶H7分別采用200 MPa、400 MPa、500 MPa(25℃，5 min)進行超高壓處理，分別應(yīng)用掃描電鏡、透射電鏡、差示量熱掃描儀對超高壓處理前后菌體細胞表面形態(tài)、內(nèi)部結(jié)構(gòu)變化、菌體DNA和核糖體熱穩(wěn)定性變化及細胞整體焓變變

5、化進行觀察和分析。掃描電鏡結(jié)果表明，超高壓可導(dǎo)致菌體表面凹陷、細胞膜破裂、變形等形態(tài)異常，且隨著壓強升高形態(tài)變化越明顯，400 MPa、500 MPa處理后菌體尺寸顯著減小(P＜0.05)。透射電鏡結(jié)果表明，超高壓可導(dǎo)致菌體細胞變形、質(zhì)壁分離、細胞內(nèi)出現(xiàn)光透明區(qū)、細胞膜破裂等變化，且隨著壓強升高結(jié)構(gòu)變化越嚴重。差示量熱掃描結(jié)果表明，超高壓破壞了菌體的核糖體結(jié)構(gòu)，使核糖體內(nèi)部結(jié)構(gòu)無序性增加，且超高壓對菌體的滅活與DNA無關(guān)。
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6、、超高壓對大腸桿菌O157∶H7細胞膜生理狀態(tài)的影響
　　大腸桿菌O157∶H7分別采用200 MPa、400 MPa、500MPa(25℃，5 min)進行超高壓處理，分別從細胞膜通透性、離子外泄量、Na+K+-ATP酶活性和Ca2+Mg2+-ATP酶活性、膜脂肪酸組成四個方面來研究大腸桿菌O157∶H7細胞膜生理狀態(tài)的變化。結(jié)果表明，超高壓處理后的菌體細胞膜通透性增加，Na+、K+、Mg2+、Ca2+離子大量外泄，Na+K+-

7、ATP酶活性和Ca2+Mg2+-ATP酶活性下降，菌體的飽和脂肪酸與不飽和脂肪酸的比例降低。除Na+離子外泄情況，隨著處理壓強越高，對大腸桿菌O157∶H7細胞膜生理特性的破壞越嚴重。
　　4、基于iTRAQ技術(shù)的超高壓誘導(dǎo)的大腸桿菌O157∶H7損傷相關(guān)蛋白質(zhì)組分析
　　實驗一結(jié)果表明400 MPa5 min產(chǎn)生損傷狀態(tài)的大腸桿菌O157∶H7最多，因此本實驗對大腸桿菌O157∶H7進行400MPa5 min超高壓處理，應(yīng)

8、用基于iTRAQ的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析差異表達蛋白。通過差異性篩選獲得差異蛋白135個，其中4個差異蛋白顯著上調(diào)，其他均下調(diào)。差異蛋白的GO富集分析表明，超高壓處理后一共富集83個生物過程、14個細胞成分、50個分子功能，其中分別有11個、4個、7個與對照組存在顯著性差異(P＜0.05)。Pathway分析共得到差異蛋白基因所參與的32條Pathway通路，篩選出2條特異Pathway通路(P＜0.05)。結(jié)果表明，超高壓對大腸桿菌O15