井岡霉素和鹽霉素的高產(chǎn)機(jī)理與改造.pdf

1、微生物的次級(jí)代謝產(chǎn)物一般在細(xì)胞指數(shù)生長(zhǎng)后期或者穩(wěn)定期開(kāi)始合成，它們具有多種生物活性，在醫(yī)療健康、農(nóng)牧業(yè)生產(chǎn)等領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用。負(fù)責(zé)細(xì)胞生長(zhǎng)的初級(jí)代謝和負(fù)責(zé)代謝產(chǎn)物合成的次級(jí)代謝之間存在密切關(guān)系，次級(jí)代謝所需的前體、能量和還原力來(lái)源于初級(jí)代謝，而初級(jí)代謝本身同樣會(huì)消耗這些前體、能量和還原力用于細(xì)胞生長(zhǎng)。以多組學(xué)的數(shù)據(jù)分析為基礎(chǔ)，闡明抗生素的高產(chǎn)機(jī)理，弱化初級(jí)代謝途徑，削弱或減緩細(xì)胞生長(zhǎng)速率，縮短次級(jí)代謝產(chǎn)物的發(fā)酵周期，全面提高次級(jí)代謝產(chǎn)

2、物的產(chǎn)量是本論文研究的重點(diǎn)。
　　第一部分“弱化初級(jí)代謝提高抗生素產(chǎn)量”的改造策略
　　井岡霉素是應(yīng)用范圍最廣的農(nóng)用抗生素之一，主要用來(lái)防治水稻紋枯病，同時(shí)也是治療 II型糖尿病的藥物阿卡波糖和伏格列波糖的合成前體，具有很高的經(jīng)濟(jì)附加值。通過(guò)對(duì)井岡霉素產(chǎn)生菌吸水鏈霉菌井岡變種5008（Streptomyces hygroscopicus va r. jinggangensis5008）（產(chǎn)量3-5 g/L）及其衍生的高產(chǎn)菌株

3、TL01（產(chǎn)量20-30 g/L）的比較基因組學(xué)分析，我們旨在闡明井岡霉素的高產(chǎn)機(jī)理，進(jìn)而指導(dǎo)其產(chǎn)量的進(jìn)一步提升。
　　5008和TL01全基因組精細(xì)圖譜的分析發(fā)現(xiàn)，TL01中存在總計(jì)300 kb的三個(gè)大片段區(qū)域的缺失，每個(gè)區(qū)域的單獨(dú)缺失對(duì)產(chǎn)量提高均有貢獻(xiàn)，而組合缺失突變株產(chǎn)量達(dá)到TL01的80%，是井岡霉素高產(chǎn)的關(guān)鍵因素。而隨著井岡霉素產(chǎn)量的逐步提高，菌體生物量卻表現(xiàn)出逐漸下降的趨勢(shì)，暗示生物量和井岡霉素產(chǎn)量之間存在負(fù)相關(guān)。據(jù)此

4、我們提出了“弱化初級(jí)代謝可以提高抗生素產(chǎn)量”的假說(shuō)，推斷大片段的缺失弱化了菌體的初級(jí)代謝，削弱或減緩了菌體的生長(zhǎng)，將更多的代謝流用于井岡霉素的生物合成，促進(jìn)井岡霉素產(chǎn)量的提高。基于此假說(shuō)，我們對(duì)區(qū)域Det-I和Det-III中的120個(gè)基因進(jìn)行了排查，找到了參與初級(jí)代謝過(guò)程的結(jié)構(gòu)基因和調(diào)控基因shjg115、shjg1601、shjg1609和shjg1617，它們的缺失使得產(chǎn)量均有不同程度的提高、生物量有不同程度的降低。此外，代謝組的

5、數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，在6-磷酸葡萄糖節(jié)點(diǎn)上代謝流的分配進(jìn)一步的趨向于磷酸戊糖途徑（PPP），而糖酵解途徑（EMP）和三羧酸循環(huán)（TCA）中的碳流量下降，這進(jìn)一步支持了我們提出的“弱化初級(jí)代謝可以提高抗生素產(chǎn)量”的假說(shuō)。
　　為了驗(yàn)證該假說(shuō)的普適性，我們?cè)诩t色糖多孢菌屬、鏈霉菌屬和小單胞菌屬的抗生素產(chǎn)生菌中對(duì)糖酵解途徑和三羧酸循環(huán)中多個(gè)催化步驟的同功基因進(jìn)行了敲除，擾動(dòng)初級(jí)代謝，減緩細(xì)胞生長(zhǎng)，成功實(shí)現(xiàn)了紅霉素 A、林可霉素 A和慶大霉素C

6、組分產(chǎn)量的提高。此外，在阿維菌素高產(chǎn)菌株阿維鏈霉菌76-5中組合缺失檸檬酸合成酶基因、琥珀酰輔酶 A合成酶基因和琥珀酸脫氫酶基因，突變株產(chǎn)量提高了0.77 g/L，增幅達(dá)到52%。但是進(jìn)一步弱化初級(jí)代謝減少生物量，產(chǎn)量反而銳減，暗示著一定的生物量積累是抗生素高產(chǎn)的重要前提。
　　另外，轉(zhuǎn)錄芯片數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)線型質(zhì)粒pSHJG1在TL01中整體呈現(xiàn)低表達(dá)趨勢(shì)，推斷pSHJG1與井岡霉素的合成沒(méi)有正相關(guān)性，可以被進(jìn)一步消除，降低產(chǎn)生菌基

7、因組的復(fù)雜性。質(zhì)粒消除突變株中井岡霉素及其前體效氧胺的產(chǎn)量均有大幅提高，但是生物量下降，而生物合成基因簇的轉(zhuǎn)錄量保持不變。隨后我們?cè)趐SHJG1中確定了和初級(jí)代謝相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因，使用valA基因啟動(dòng)子在突變株中進(jìn)行基因回補(bǔ)，發(fā)現(xiàn)基因pshjg1.69和pshjg1.72的回補(bǔ)使得井岡霉素產(chǎn)量和生物量均恢復(fù)到接近出發(fā)菌株的水平。
　　無(wú)論是初級(jí)代謝的弱化還是線型質(zhì)粒的消除，它們都能夠弱化或者減緩細(xì)胞生長(zhǎng)，進(jìn)而促進(jìn)抗生素產(chǎn)量的提高。由

8、于放線菌初級(jí)代謝途徑和細(xì)胞生長(zhǎng)息息相關(guān)，而且相對(duì)大的基因組中普遍存在多個(gè)同功基因，因此弱化初級(jí)代謝以提高抗生素產(chǎn)量的策略更具有普適性。
　　第二部分鹽霉素產(chǎn)生菌基因組解析及定向高產(chǎn)改造
　　鹽霉素是聚醚類抗生素的典型代表，由于具有治療雞球蟲(chóng)病的活性，在畜牧業(yè)被廣泛使用。最近發(fā)現(xiàn)它也具有潛在的殺滅腫瘤干細(xì)胞的活性。鹽霉素發(fā)酵過(guò)程表現(xiàn)出很強(qiáng)的豆油利用偏好性，且產(chǎn)量會(huì)隨著豆油濃度的提高而增加，工業(yè)發(fā)酵水平達(dá)到70 g/L以上。但是

9、迄今為止，對(duì)其高產(chǎn)機(jī)理和豆油利用偏好性產(chǎn)生的原因尚不知曉。
　　鹽霉素產(chǎn)生菌白色鏈霉菌DSM41398（Streptomyces albus DSM41398）的全基因組精細(xì)圖譜由本實(shí)驗(yàn)室測(cè)定，其線型染色體全長(zhǎng)8,384,669 bp，無(wú)線型質(zhì)粒存在。和其他常見(jiàn)鏈霉菌基因組的比較分析發(fā)現(xiàn)，DSM41398中參與脂代謝的基因比例和數(shù)量是最高的，與豆油分解和β氧化相關(guān)基因總數(shù)達(dá)到48個(gè)，且其中基因fadD、acd、paa、fadJ和f

10、adA均表現(xiàn)出豆油誘導(dǎo)表達(dá)的現(xiàn)象；而與此相反，參與碳水化合物代謝的基因比例是最低的，這暗示著菌株具有內(nèi)在的強(qiáng)化的脂代謝能力和弱化的糖代謝能力，與其特殊的豆油偏好性表型恰好吻合。
　　除了鹽霉素生物合成基因簇以外，DSM41398的染色體中還存在其他9個(gè)I型PKS/PKS-NRPS生物合成基因簇，其中7個(gè)是活躍表達(dá)的，它們可能會(huì)和鹽霉素生物合成競(jìng)爭(zhēng)前體，不利于鹽霉素的產(chǎn)生。對(duì)7個(gè)活躍表達(dá)的基因簇進(jìn)行逐個(gè)敲除后發(fā)現(xiàn)，除了PKS-5，其

11、他基因簇的中斷都有助于鹽霉素產(chǎn)量不同程度的提高，其中PKS-NRPS-2和PKS-6的缺失突變株產(chǎn)量提高最為顯著，分別提高了8.5倍和2.67倍，但是它們的組合缺失突變株的產(chǎn)量卻不能被進(jìn)一步提升。通過(guò)LC-MS/MS進(jìn)行了胞內(nèi)輔酶A的定量分析，我們發(fā)現(xiàn)組合缺失突變株中，前體丙二酰輔酶A和甲基丙二酰輔酶A的濃度均比單獨(dú)缺失突變株的高，但是乙基丙二酰輔酶A的濃度基本保持不變，由此成為產(chǎn)量進(jìn)一步提高新的限制因素。通過(guò)超量表達(dá)了巴豆酰輔酶A還原

12、酶基因ccr，我們有效提高了乙基丙二酰輔酶A的胞內(nèi)濃度，并最終將組合缺失突變株的鹽霉素產(chǎn)量提高至6.6 g/L，達(dá)到了出發(fā)菌株的10倍左右。在高產(chǎn)菌株中我們使用同樣的檢測(cè)手段和改造策略，也實(shí)現(xiàn)了鹽霉素產(chǎn)量的進(jìn)一步提升。
　　綜上所述，本論文通過(guò)基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、代謝組學(xué)的手段，解析了井岡霉素和鹽霉素的高產(chǎn)機(jī)理，并定向改造高產(chǎn)菌株，得到了產(chǎn)量進(jìn)一步提高的衍生菌株。此外，本論文中提出的“弱化初級(jí)代謝提高抗生素產(chǎn)量”，“線型質(zhì)粒消除”