用于制備抗菌肽的山羊成纖維細(xì)胞系與雞輸卵管上皮細(xì)胞系的建立.pdf

1、抗菌肽因具有廣譜殺菌、抗腫瘤、抗病毒和抗原蟲等特點而成為新型抗生素類藥物的研究熱點。為了加快抗菌肽的生產(chǎn)速度，提高抗菌肽的產(chǎn)量，本研究在克隆獲得中國林蛙皮膚抗菌肽基因Temporin-1CEa的基礎(chǔ)上，構(gòu)建山羊乳腺特異性表達(dá)載體pBC1-neo-Temporin-1CEa，將其線性片段導(dǎo)入山羊成纖維細(xì)胞中，通過G418篩選獲得轉(zhuǎn)抗菌肽基因的山羊成纖維細(xì)胞系;利用克隆獲得的雞輸卵管上皮特異表達(dá)調(diào)控序列5OV和Temporin-1CEa基因

2、，構(gòu)建雞輸卵管特異性表達(dá)抗菌肽的雙順反子逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pMX-GFP-5OV-Temporin1CEa;為了建立雞輸卵管基因表達(dá)調(diào)控的體外模型，在建立雞輸卵管封閉內(nèi)部消化法(Obturated Interior Digesting，OID法)的基礎(chǔ)上建立了雞輸卵管上皮細(xì)胞系;采用脂質(zhì)體法將pMX-GFP-5OV-Temporin1CEa載體轉(zhuǎn)染至雞輸卵管上皮細(xì)胞中，檢測其在細(xì)胞中的表達(dá)情況。本研究的主要結(jié)果如下:
　　1.山羊乳腺

3、特異性表達(dá)載體的構(gòu)建根據(jù)GenBank中的參照序列克隆Temporin-1CEa基因并將其連入pBC1-neo載體中，PCR鑒定、酶切鑒定及測序結(jié)果均顯示成功獲得山羊乳腺特異性表達(dá)載體pBC1-neo-Temporin-1CEa;
　　2.轉(zhuǎn)抗菌肽基因山羊成纖維細(xì)胞系的建立由山羊耳緣組織獲得的原代成纖維細(xì)胞傳代培養(yǎng)后轉(zhuǎn)入pBC1-neo-Temporin-1CEa線性片段，用含有300μ g/ml G418的培養(yǎng)基篩選出轉(zhuǎn)基因山羊

4、成纖維細(xì)胞;對獲得的細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)觀察，以及群體倍增時間、冷凍復(fù)蘇、染色體核型、細(xì)胞免疫組織化學(xué)等檢測，結(jié)果顯示本研究獲得了具有良好生長特性及遺傳穩(wěn)定性的轉(zhuǎn)抗菌肽基因的山羊成纖維細(xì)胞系;
　　3.雙順反子逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建根據(jù)GenBank中的參照序列擴(kuò)增技術(shù)克隆雞卵清蛋白基因的5'調(diào)控序列(5OV)，并將其與Temporin-1 CEa基因、GFP基因連入pMX載體中，PCR鑒定、酶切鑒定及測序結(jié)果均顯示成功構(gòu)建pMX-GFP-

5、5OV-Temporin1 CEa載體;
　　4.雞輸卵管上皮細(xì)胞系的建立本研究建立了分離培養(yǎng)雞原代輸卵管上皮細(xì)胞的OID法，并對獲得的原代上皮細(xì)胞進(jìn)行了傳代培養(yǎng)、群體倍增時間、冷凍復(fù)蘇、染色體核型、細(xì)胞免疫組織化學(xué)、Marker基因表達(dá)及轉(zhuǎn)染能力等一系列的鑒定與檢測。其結(jié)果為:與現(xiàn)有的剪切法和刮取法無法獲得雞輸卵管上皮細(xì)胞系不同，采用OID法可以建立雞輸卵管上皮細(xì)胞系，且細(xì)胞具有正常的形態(tài)、良好的生長特性及穩(wěn)定性的遺傳特性;表明

6、本研究成功建立了雞輸卵管上皮細(xì)胞系，并命名為XYF-142;
　　5.雙順反子逆轉(zhuǎn)錄病毒載體與XYF-142細(xì)胞模型的檢測將pMX-GFP-5OV-Temporin-1CEa載體轉(zhuǎn)染至XYF-142細(xì)胞中后，觀察GFP基因的表達(dá)情況并檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞中Temporin-1CEa基因的轉(zhuǎn)錄情況;其結(jié)果顯示不僅在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中觀察到GFP基因的表達(dá)，而且在轉(zhuǎn)染細(xì)胞總RNA中檢測到Temporin-1CEa基因的轉(zhuǎn)錄。表明本研究構(gòu)建的雞輸卵管特

7、異性表達(dá)Temporin-1CEa基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pMX-GFP-5OV-Temporin-1CEa具有雙順反子特性;與此同時，表明本研究建立的雞輸卵管上皮細(xì)胞系XYF-142可以作為外源基因在雞輸卵管中表達(dá)調(diào)控的體外模型。
　　綜上所述，本研究成功獲得轉(zhuǎn)抗菌肽基因的山羊成纖維細(xì)胞系，并成功構(gòu)建雞輸卵管特異性表達(dá)Temporin-1CEa基因的雙順反子逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pMX-GFP-5 OV-Temporin-1CEa，及可作為