長鏈非編碼RNA HOXC-AS1在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及機(jī)制研究.pdf

1、腦膠質(zhì)瘤是成人中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最常見的原發(fā)性惡性腫瘤，占顱內(nèi)腫瘤的比例超過40％，而且其中高級別膠質(zhì)瘤所占比例較高。目前膠質(zhì)瘤的治療以手術(shù)切除為主，輔以放、化療。盡管近些年來膠質(zhì)瘤的治療手段取得了一定的進(jìn)步，但惡性膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后并沒有達(dá)到理想的效果，因此，惡性膠質(zhì)瘤仍被視為人類在腫瘤的治療方面沒有取得顯著進(jìn)展的腫瘤之一。毫無疑問，腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)多因素的過程。隨著對腫瘤研究的深入，人們開始從基因?qū)用嫒ソ议_腫瘤的發(fā)生、發(fā)展機(jī)理。因此

2、，探索膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制，也成為目前膠質(zhì)瘤研究的熱點(diǎn)。
　　長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，IncRNA）是一類轉(zhuǎn)錄本超過200個(gè)核苷酸，并且不編碼蛋白的RNA。起初，它被視為是基因轉(zhuǎn)錄中的“噪音”，不具有生物學(xué)功能。然而，近些年來的研究表明，長鏈非編碼RNA在基因表達(dá)的調(diào)控以及表觀遺傳學(xué)等方面具有重要的作用，能夠在多個(gè)層面參與細(xì)胞分化和個(gè)體發(fā)育的過程，并與很多疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。盡管長鏈非

3、編碼RNA在腫瘤中的研究取得了一定的成果，但是絕大多數(shù)的lncRNA作用機(jī)制仍不清楚。因而，這也是今后基礎(chǔ)研究的一個(gè)重要方向。我們利用前期芯片數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)了一個(gè)在膠質(zhì)瘤中異常表達(dá)的長鏈非編碼RNA HOXC-AS1，目前沒有發(fā)現(xiàn)關(guān)于其在腫瘤研究中的相關(guān)報(bào)道，因此，這也成為我們興趣所在。
　　本研究首先明確長鏈非編碼RNA HOXC-AS1在不同級別膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)情況，結(jié)合患者臨床指標(biāo)及其預(yù)后情況，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析其相關(guān)性。緊接著，我們根

4、據(jù)HOXC-AS1的基因設(shè)計(jì)干擾靶點(diǎn)，并利用體外功能實(shí)驗(yàn)，研究下調(diào)HOXC-AS1后膠質(zhì)瘤細(xì)胞的細(xì)胞生物學(xué)行為變化。然后，利用實(shí)驗(yàn)篩選出HOXC-AS1靶基因HOXC8,初步探索HOXC-AS1的可能作用機(jī)制。實(shí)驗(yàn)共分為三個(gè)部分:第一部分，長鏈非編碼RNA HOXC-AS1在腦膠質(zhì)瘤中表達(dá)研究;第二部分，下調(diào)HOXC-AS1后對膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251和A172的生物學(xué)行為影響研究。第三部分，HOXC-AS1的靶基因篩選及初步機(jī)制研究。

5、r>　　第一部分:長鏈非編碼RNA HOXC-AS1在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)研究
　　目的:初步研究長鏈非編碼RNA HOXC-AS1在腦膠質(zhì)瘤和正常腦組織中的相對表達(dá)情況。結(jié)合患者臨床指標(biāo)，分析長鏈非編碼RNA HOXC-AS1表達(dá)水平與患者各種臨床指標(biāo)間的相關(guān)性。
　　方法:采用qRT-PCR方法檢測HOXC-AS1在不同級別膠質(zhì)瘤組織以及正常腦組織中的表達(dá)情況，利用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析HOXC-AS1的表達(dá)水平與各種臨床指標(biāo)間的相關(guān)性

6、。并利用Kaplan-Meier生存分析HOXC-AS1的相對表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的相關(guān)性。
　　結(jié)果:利用qRT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測不同級別膠質(zhì)瘤和正常腦組織HOXC-AS1相對表達(dá)水平，結(jié)果顯示，HOXC-AS1在高級別膠質(zhì)瘤中的相對表達(dá)量明顯高于低級別膠質(zhì)瘤和正常腦組織。結(jié)合患者各種臨床指標(biāo)，結(jié)果顯示HOXC-AS1表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤的級別呈正相關(guān)。同時(shí)，利用Kaplan-Meier生存分析HOXC-AS1的相對表達(dá)水平與患者

7、總生存時(shí)間呈負(fù)相關(guān)。
　　結(jié)論:HOXC-AS1在不同級別膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本中的相對表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤級別呈正相關(guān)。HOXC-AS1的相對表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤患者預(yù)后呈負(fù)相關(guān)。
　　第二部分:下調(diào)HOXC-AS1后對膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251和A172的生物學(xué)行為影響研究
　　目的:初步研究HOXC-AS1在膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中的功能作用
　　方法:設(shè)計(jì)合成HOXC-AS1的干擾序列，利用Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染膠質(zhì)瘤細(xì)

8、胞系，觀察敲減HOXC-AS1膠質(zhì)瘤細(xì)胞系后膠質(zhì)瘤細(xì)胞的一系列體外功能變化情況。
　　結(jié)果:將干擾RNA轉(zhuǎn)染膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251和A172后，qRT-PCR結(jié)果顯示HOXC-AS1的表達(dá)量明顯下降。利用WST-1實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖能力，發(fā)現(xiàn)敲減HOXC-AS1后膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖能力下降;Transwell實(shí)驗(yàn)顯示敲減HOXC-AS1后膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力下降;流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示敲減HOXC-AS1后膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡比例增加，細(xì)

9、胞周期以及周期相關(guān)蛋白出現(xiàn)改變。
　　結(jié)論:HOXC-AS1能夠促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、侵襲與遷移能力，并且抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡。
　　第三部分:HOXC-AS1的靶基因HOXC8篩選及初步機(jī)制研究
　　目的:研究HOXC-AS1與HOXC8在膠質(zhì)瘤組織樣本中表達(dá)相關(guān)性，初步探索HOXC-AS1在膠質(zhì)瘤中可能通過靶基因HOXC8的作用機(jī)制。
　　方法:利用qRT-PCR實(shí)驗(yàn)首先檢測敲減HOXC-AS1后HOXC家族

10、中各基因的表達(dá)變化情況，再檢測HOXC8不同級別膠質(zhì)瘤組織以及正常腦組織中的表達(dá)情況，采用皮爾森相關(guān)性分析法檢測HOXC-AS1和HOXC8在膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本中表達(dá)量的相關(guān)性。利用Western blot和免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測HOXC8在組織標(biāo)本中的表達(dá)情況。利用體外功能實(shí)驗(yàn)，觀察在細(xì)胞系中敲減HOXC-AS1后HOXC8在蛋白水平的變化情況。
　　結(jié)果:qRT-PCR實(shí)驗(yàn)表明敲減HOXC-AS1后HOXC8表達(dá)量下降，皮爾遜相關(guān)性