長鏈非編碼RNA DILC在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及功能初探.pdf

1、目的：神經(jīng)膠質(zhì)瘤又稱膠質(zhì)細(xì)胞瘤，簡稱膠質(zhì)瘤，發(fā)生于神經(jīng)外胚層，是最常見的顱內(nèi)腫瘤，占全部腦腫瘤的33.3~58.6％。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)病率為3～10人/10萬人，占全身惡性腫瘤的1％～3％，神經(jīng)膠質(zhì)瘤侵襲性很強(qiáng)，絕大多數(shù)病人預(yù)后很差，即使采取外科手術(shù)、放療及化療等綜合療法，中位數(shù)存活期仍不超過14個(gè)月，因此對于膠質(zhì)瘤的研究是一個(gè)非常重要的課題。隨著研究的進(jìn)展，人們將會(huì)對膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展機(jī)制有更深入的認(rèn)識(shí)，為早期診斷膠質(zhì)瘤提

2、供新的生物標(biāo)記物，并為膠質(zhì)瘤的治療提供新的靶點(diǎn)以及理論基礎(chǔ)。
　　近幾年，隨著新技術(shù)的應(yīng)用，先前的認(rèn)知正被逐漸顛覆，從全基因組和轉(zhuǎn)錄組測序分析得出，有機(jī)體的復(fù)雜程度可能是由非編碼RNA調(diào)控的，這屬于基因組的非編碼部分。因此，如今的研究重心逐漸轉(zhuǎn)移到了一個(gè)最普遍但缺乏認(rèn)知的RNA種類：LncRNA。
　　LncRNA常常是這樣定義的：一個(gè)不編碼蛋白質(zhì)的RNA分子，其長度超過200個(gè)核苷酸。近年來我們識(shí)別了數(shù)量巨大的lncRNA

3、，接下來需要進(jìn)一步探究lncRNA的細(xì)胞功能。過去十年，學(xué)界的共識(shí)是這些大分子轉(zhuǎn)錄物僅僅是所謂的“轉(zhuǎn)錄噪聲”或克隆產(chǎn)物。但是，大量的lncRNA表現(xiàn)出了精確的生物調(diào)控性或是明確的進(jìn)化保守性，這就支持一個(gè)假說：這些轉(zhuǎn)錄物具有重要的功能。事實(shí)上，近年來的研究了覆蓋了大量lncRNA，許多都起到了重要的調(diào)控功能。
　　LncRNA DILC是近來經(jīng)由高通量測序以及Q-PCR確認(rèn)及驗(yàn)證的長鏈非編碼RNA，研究發(fā)現(xiàn)，DILC在肝癌中通過抑制

4、自分泌IL-6/STAT3軸來抑制肝癌干細(xì)胞的自我更新，DILC在肝癌干細(xì)胞中是明顯下調(diào)的，而DILC又會(huì)抑制肝癌干細(xì)胞的擴(kuò)增，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，DILC的敲除會(huì)進(jìn)一步促進(jìn)肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展，研究顯示，DILC通過抑制JAK2/STAT3的活化來約束肝癌干細(xì)胞的擴(kuò)增，其中DILC調(diào)節(jié)了IL-6/JAK2/STAT3的自分泌信號(hào)傳遞，下調(diào)DILC時(shí)可以發(fā)現(xiàn)，IL-6的自分泌信號(hào)傳遞會(huì)變得更活躍，由此也會(huì)進(jìn)一步增強(qiáng)IL-6/STAT3通路的活化

5、。而IL-6與大量惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中，IL-6的水平是明顯上升的，敲除IL-6的膠質(zhì)瘤細(xì)胞其細(xì)胞生長明顯受限，大量的統(tǒng)計(jì)顯示 IL-6水平明顯上升的神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者預(yù)后很差，同時(shí)其腫瘤侵襲性很強(qiáng)。
　　截至目前，沒有研究指出DILC在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的表達(dá)水平及其扮演的角色，而有關(guān)DILC與IL-6/STAT3信號(hào)級(jí)聯(lián)的關(guān)系的報(bào)道使得DILC在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中具有差異化表達(dá)以及一定調(diào)控功能的預(yù)期變得很具前景。因此，本研究

6、通過Q-PCR技術(shù)檢測DILC在正常腦組織及不同級(jí)別神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的表達(dá)情況，闡述DILC在正常腦組織及不同級(jí)別神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的表達(dá)差異及其與腫瘤級(jí)別的關(guān)聯(lián)性，同時(shí)構(gòu)建小干擾 RNA，轉(zhuǎn)染膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87、U251，通過克隆形成實(shí)驗(yàn)，CCK-8細(xì)胞增殖活力分析觀察DILC對于膠質(zhì)瘤細(xì)胞生物學(xué)功能的影響，并探討可能的作用機(jī)制。
　　方法：
　　1、臨床標(biāo)本的采集：從河北醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院神經(jīng)外科采集近一年的不同級(jí)別神經(jīng)膠質(zhì)瘤及正

7、常腦組織的標(biāo)本。以2007年WHO標(biāo)準(zhǔn)病理分級(jí)為標(biāo)準(zhǔn)，采集I-Ⅳ級(jí)的神經(jīng)膠質(zhì)瘤標(biāo)本共36例，其中I-II級(jí)、III級(jí)、IV級(jí)神經(jīng)膠質(zhì)瘤標(biāo)本分別為23例、7例、6例，同時(shí)取正常腦組織標(biāo)本7例（對照用）。
　　2、臨床標(biāo)本的檢測與分析：從GeneBank調(diào)取DILC全長序列，設(shè)計(jì)引物，采用Q-PCR技術(shù)從RNA水平定量檢測DILC在正常腦組織及不同級(jí)別膠質(zhì)瘤的表達(dá)情況。
　　3、構(gòu)建小干擾RNA，轉(zhuǎn)染膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87、U251，

8、通過克隆形成實(shí)驗(yàn)，CCK-8細(xì)胞增殖活力分析的方法觀察DILC對膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖功能的影響。
　　4、應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　結(jié)果：應(yīng)用Q-PCR方法，在經(jīng)過對實(shí)驗(yàn)組神經(jīng)膠質(zhì)瘤及正常腦組織標(biāo)本細(xì)胞總RNA進(jìn)行提取、純度檢測(1.8

9、結(jié)果顯示，lncRNA DILC在膠質(zhì)瘤組中的表達(dá)與正常腦組織組相比明顯降低，且 P值均小于0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；組間比較顯示在不同級(jí)別神經(jīng)膠質(zhì)瘤中（I-II級(jí)、III級(jí)、IV級(jí)）lncRNA DILC的表達(dá)隨著腫瘤級(jí)別的增加呈現(xiàn)遞減趨勢，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P值均小于0.05。上述研究結(jié)果在表明，神經(jīng)膠質(zhì)瘤中l(wèi)ncRNA的表達(dá)水平較正常腦組織明顯降低，且膠質(zhì)瘤的級(jí)別越高表達(dá)水平越低，呈現(xiàn)遞減趨勢。
　　構(gòu)建小干擾RNA，轉(zhuǎn)染

10、膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87、U251，經(jīng)由Q-PCR驗(yàn)證細(xì)胞模型構(gòu)建成功后，進(jìn)行克隆形成實(shí)驗(yàn)以及 CCK-8增殖活力分析，結(jié)果表明，與對照組細(xì)胞相比，DILC敲低后的膠質(zhì)瘤細(xì)胞克隆形成能力減弱，克隆形成數(shù)目增加；CCK-8檢測表明，DILC可以加速實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的增殖。
　　結(jié)論：
　　1、 DILC在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的表達(dá)水平較正常腦組織較低，在不同級(jí)別神經(jīng)膠質(zhì)瘤中表達(dá)水平存在明顯差異，隨著神經(jīng)膠質(zhì)瘤級(jí)別的升高而呈現(xiàn)遞減趨勢，與惡性程度密切