長鏈非編碼RNA DILC在膠質(zhì)瘤中的表達及功能初探.pdf

1、目的：神經(jīng)膠質(zhì)瘤又稱膠質(zhì)細胞瘤，簡稱膠質(zhì)瘤，發(fā)生于神經(jīng)外胚層，是最常見的顱內(nèi)腫瘤，占全部腦腫瘤的33.3~58.6％。據(jù)相關(guān)文獻報道，神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)病率為3～10人/10萬人，占全身惡性腫瘤的1％～3％，神經(jīng)膠質(zhì)瘤侵襲性很強，絕大多數(shù)病人預(yù)后很差，即使采取外科手術(shù)、放療及化療等綜合療法，中位數(shù)存活期仍不超過14個月，因此對于膠質(zhì)瘤的研究是一個非常重要的課題。隨著研究的進展，人們將會對膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展機制有更深入的認識，為早期診斷膠質(zhì)瘤提

2、供新的生物標記物，并為膠質(zhì)瘤的治療提供新的靶點以及理論基礎(chǔ)。
　　近幾年，隨著新技術(shù)的應(yīng)用，先前的認知正被逐漸顛覆，從全基因組和轉(zhuǎn)錄組測序分析得出，有機體的復(fù)雜程度可能是由非編碼RNA調(diào)控的，這屬于基因組的非編碼部分。因此，如今的研究重心逐漸轉(zhuǎn)移到了一個最普遍但缺乏認知的RNA種類：LncRNA。
　　LncRNA常常是這樣定義的：一個不編碼蛋白質(zhì)的RNA分子，其長度超過200個核苷酸。近年來我們識別了數(shù)量巨大的lncRNA

3、，接下來需要進一步探究lncRNA的細胞功能。過去十年，學(xué)界的共識是這些大分子轉(zhuǎn)錄物僅僅是所謂的“轉(zhuǎn)錄噪聲”或克隆產(chǎn)物。但是，大量的lncRNA表現(xiàn)出了精確的生物調(diào)控性或是明確的進化保守性，這就支持一個假說：這些轉(zhuǎn)錄物具有重要的功能。事實上，近年來的研究了覆蓋了大量lncRNA，許多都起到了重要的調(diào)控功能。
　　LncRNA DILC是近來經(jīng)由高通量測序以及Q-PCR確認及驗證的長鏈非編碼RNA，研究發(fā)現(xiàn)，DILC在肝癌中通過抑制

4、自分泌IL-6/STAT3軸來抑制肝癌干細胞的自我更新，DILC在肝癌干細胞中是明顯下調(diào)的，而DILC又會抑制肝癌干細胞的擴增，動物實驗發(fā)現(xiàn)，DILC的敲除會進一步促進肝細胞癌的發(fā)生發(fā)展，研究顯示，DILC通過抑制JAK2/STAT3的活化來約束肝癌干細胞的擴增，其中DILC調(diào)節(jié)了IL-6/JAK2/STAT3的自分泌信號傳遞，下調(diào)DILC時可以發(fā)現(xiàn)，IL-6的自分泌信號傳遞會變得更活躍，由此也會進一步增強IL-6/STAT3通路的活化

5、。而IL-6與大量惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中，IL-6的水平是明顯上升的，敲除IL-6的膠質(zhì)瘤細胞其細胞生長明顯受限，大量的統(tǒng)計顯示 IL-6水平明顯上升的神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者預(yù)后很差，同時其腫瘤侵襲性很強。
　　截至目前，沒有研究指出DILC在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的表達水平及其扮演的角色，而有關(guān)DILC與IL-6/STAT3信號級聯(lián)的關(guān)系的報道使得DILC在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中具有差異化表達以及一定調(diào)控功能的預(yù)期變得很具前景。因此，本研究

6、通過Q-PCR技術(shù)檢測DILC在正常腦組織及不同級別神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的表達情況，闡述DILC在正常腦組織及不同級別神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的表達差異及其與腫瘤級別的關(guān)聯(lián)性，同時構(gòu)建小干擾 RNA，轉(zhuǎn)染膠質(zhì)瘤細胞U87、U251，通過克隆形成實驗，CCK-8細胞增殖活力分析觀察DILC對于膠質(zhì)瘤細胞生物學(xué)功能的影響，并探討可能的作用機制。
　　方法：
　　1、臨床標本的采集：從河北醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院神經(jīng)外科采集近一年的不同級別神經(jīng)膠質(zhì)瘤及正

7、常腦組織的標本。以2007年WHO標準病理分級為標準，采集I-Ⅳ級的神經(jīng)膠質(zhì)瘤標本共36例，其中I-II級、III級、IV級神經(jīng)膠質(zhì)瘤標本分別為23例、7例、6例，同時取正常腦組織標本7例（對照用）。
　　2、臨床標本的檢測與分析：從GeneBank調(diào)取DILC全長序列，設(shè)計引物，采用Q-PCR技術(shù)從RNA水平定量檢測DILC在正常腦組織及不同級別膠質(zhì)瘤的表達情況。
　　3、構(gòu)建小干擾RNA，轉(zhuǎn)染膠質(zhì)瘤細胞U87、U251，

8、通過克隆形成實驗，CCK-8細胞增殖活力分析的方法觀察DILC對膠質(zhì)瘤細胞增殖功能的影響。
　　4、應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計學(xué)軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析。
　　結(jié)果：應(yīng)用Q-PCR方法，在經(jīng)過對實驗組神經(jīng)膠質(zhì)瘤及正常腦組織標本細胞總RNA進行提取、純度檢測(1.8

9、結(jié)果顯示，lncRNA DILC在膠質(zhì)瘤組中的表達與正常腦組織組相比明顯降低，且 P值均小于0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；組間比較顯示在不同級別神經(jīng)膠質(zhì)瘤中（I-II級、III級、IV級）lncRNA DILC的表達隨著腫瘤級別的增加呈現(xiàn)遞減趨勢，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P值均小于0.05。上述研究結(jié)果在表明，神經(jīng)膠質(zhì)瘤中l(wèi)ncRNA的表達水平較正常腦組織明顯降低，且膠質(zhì)瘤的級別越高表達水平越低，呈現(xiàn)遞減趨勢。
　　構(gòu)建小干擾RNA，轉(zhuǎn)染

10、膠質(zhì)瘤細胞U87、U251，經(jīng)由Q-PCR驗證細胞模型構(gòu)建成功后，進行克隆形成實驗以及 CCK-8增殖活力分析，結(jié)果表明，與對照組細胞相比，DILC敲低后的膠質(zhì)瘤細胞克隆形成能力減弱，克隆形成數(shù)目增加；CCK-8檢測表明，DILC可以加速實驗組細胞的增殖。
　　結(jié)論：
　　1、 DILC在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的表達水平較正常腦組織較低，在不同級別神經(jīng)膠質(zhì)瘤中表達水平存在明顯差異，隨著神經(jīng)膠質(zhì)瘤級別的升高而呈現(xiàn)遞減趨勢，與惡性程度密切