日本三角渦蟲Spsb基因的克隆及表達(dá)分析.pdf

1、SPSB蛋白家族由四個高度保守的成員（SPSB1-SPSB4）組成，共同特征是其氨基酸包含SPRY結(jié)構(gòu)域和羧基(C)端的SOCS-box基序。雖然在高等動物和一些無脊椎動物中已克隆了Spsb基因并對其表達(dá)模式進(jìn)行了分析，但是，到目前為止，這些基因確切的功能尚不清楚。本研究以日本三角渦蟲（Dugesia japonica）為實驗材料，克隆了DjSpsb基因的全長cDNA序列并對其表達(dá)模式進(jìn)行了系統(tǒng)分析，結(jié)果如下：
　　1、利用RAC

2、E技術(shù)首次在日本三角渦蟲中克隆了Spsb基因的全長cDNA序列。DjSpsb基因的cDNA全長為1251 bp，包含一個105 bp的5'端非翻譯區(qū)(5'UTR)和一個87 bp的3'端非翻譯區(qū)(3'UTR)。其中3'端非翻譯區(qū)包含一個poly(A)尾和一個終止密碼子。最大開放閱讀框(ORF)為1059 bp，編碼一個由352個氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)。
　　2、利用ExPASy，TMHMM2.0、SMART、InterPro等其他

3、在線軟件對該基因所推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，結(jié)果表明:DjSPSB蛋白的分子量為40.90 kDa，理論等電點為9.04，含有一個保守的SPRY結(jié)構(gòu)域和一個SOCS盒，為親水性核蛋白，存在多個磷酸化位點，無信號肽且不存在跨膜區(qū)。
　　3、根據(jù)該基因所推導(dǎo)的氨基酸序列利用用貝葉斯MrBayes3.1.2構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明DjSpsb在多細(xì)胞動物進(jìn)化過程中高度保守，且與Spsb1，Spsb2和Spsb4有較高

4、的同源性。
　　4、利用整體原位雜交、切片原位雜交和實時熒光定量PCR技術(shù)研究了DjSpsb基因在整體及再生渦蟲中的時空表達(dá)模式。結(jié)果表明:在性未成熟的整體渦蟲中，DjSpsb主要在頭部表達(dá)且邊緣部位陽性信號較強(qiáng)，此外，DjSpsb在神經(jīng)組織和腸支表達(dá);在性成熟的個體中，陽性信號主要在頭部、睪丸和卵黃腺部位表達(dá)，卵巢部位不表達(dá);在再生個體中，陽性信號在再生胚基表達(dá)。RT-PCR結(jié)果顯示，在尾再生頭部分，DjSpsb基因在切割后1，