東亞三角渦蟲(chóng)Dj14-3-3ε-like基因的進(jìn)化、表達(dá)和功能分析.pdf

1、東亞三角渦蟲(chóng)（Dujesia japonica）是扁形動(dòng)物門(mén)的代表動(dòng)物，也是首次出現(xiàn)三胚層的兩側(cè)對(duì)稱(chēng)生物。同時(shí)，渦蟲(chóng)具有最為簡(jiǎn)單的神經(jīng)系統(tǒng)和極強(qiáng)的再生能力和組織、器官重建能力，這些特點(diǎn)使渦蟲(chóng)已經(jīng)成為研究動(dòng)物神經(jīng)再生的重要模型動(dòng)物。14-3-3蛋白家族在基因調(diào)控中發(fā)揮作用，14-3-3ε在脊椎動(dòng)物神經(jīng)灰質(zhì)中表達(dá)，在無(wú)脊椎動(dòng)物胚胎發(fā)育參與原腸作用。本論文利用生物信息學(xué)方法研究渦蟲(chóng)Dj14-3-3ε-like基因在生物進(jìn)化上的地位，利用Nor

2、thern雜交、整體原位雜交等分子生物學(xué)手段來(lái)研究渦蟲(chóng)不同時(shí)期Dj14-3-3ε-like基因的表達(dá)情況，以期了解渦蟲(chóng)Dj14-3-3ε-like基因在胚胎發(fā)育、渦蟲(chóng)成蟲(chóng)和再生過(guò)程中的表達(dá)圖式，從而從分子水平上進(jìn)一步了解再生機(jī)理和調(diào)控機(jī)制。構(gòu)建了L4440-Dj14-3-3ε-like干擾載體，通過(guò)喂食含有dsRNA的E. coli，觀察表型變化，以推測(cè)Dj14-3-3ε-like基因在渦蟲(chóng)不同再生時(shí)期可能承擔(dān)的生物學(xué)功能。
　　

3、從東亞三角渦蟲(chóng)文庫(kù)中挑選出克隆M455，經(jīng)BLASTP確定隸屬于14-3-3ε基因家族，具有14-3-3ε蛋白的保守結(jié)構(gòu)域命名為Dj14-3-3ε-like基因。該基因cDNA由291bp組成最大開(kāi)放閱讀框（ORF），編碼96個(gè)氨基酸。利用該基因編碼的蛋白進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，表明東亞三角渦蟲(chóng)Dj14-3-3ε-like位于無(wú)脊椎動(dòng)物14-3-3ε家族分枝的基部，ε亞型位于其它各個(gè)亞型的基部，推測(cè)ε亞型是動(dòng)物各個(gè)亞型的原型。Dj14-3-3

4、ε-like基因可能保留著動(dòng)物14-3-3基因的最原始的功能。
　　利用整體原位雜交等技術(shù)研究該基因在渦蟲(chóng)體內(nèi)的表達(dá)情況。胚胎原位雜交信號(hào)位于胚胎咽及神經(jīng)系統(tǒng)；再生渦蟲(chóng)的整體原位雜交信號(hào)在神經(jīng)系統(tǒng)上，與完整的成體渦蟲(chóng)表達(dá)有一致性；被干擾的渦蟲(chóng)的再生及非再生階段的原位雜交結(jié)果也呈現(xiàn)出與完整的成體渦蟲(chóng)表達(dá)有一致性。RNAi實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Dj14-3-3ε-like基因在渦蟲(chóng)神經(jīng)系統(tǒng)再生過(guò)程中發(fā)揮一定作用，影響左右軸的建立，導(dǎo)致渦蟲(chóng)眼點(diǎn)