E3連接酶APC-CCdh1介導BRSK2通過泛素-蛋白酶體途徑進行周期性降解.pdf

1、BRSK1(SADB)和BRSK2 SADA)是AMPK家族中兩個同源基因，在腦，睪丸和胰腺中特異表達。有研究表明，BRSK1能磷酸化周期蛋白Wee1，Cdc25B和Cdc25C，從而調節(jié)Cdk1活性，最終抑制細胞周期進程。有文獻報道BRSK2同樣也能磷酸化Wee1蛋白。最新的研究發(fā)現(xiàn)，BRSK1能磷酸化γ-tubulin的Ser131，并認為BRSK1對Cdc25C的磷酸化調節(jié)是由細胞周期進程中BRSK1的活性變化調控的。而本文研究提

2、出一個新的觀點，BRSK2能通過蛋白水平的變化機制來調控細胞周期的進程。
　　細胞要順利通過細胞周期的各個進程需要非常復雜的信號通路的調控，包括各種調節(jié)因子的磷酸化和泛素化介導的蛋白降解事件的有序完成。細胞有絲分裂的有序進程需要有后期促進復合物/周期體（anaphase-promotingcomplex/cyclosome，APC/C）的調節(jié)，APC/C介導底物的降解需要共激活子Cdh1和Cdc20的激活作用，大部分被識別并降解的

3、底物中都有降解子Dbox和/或KENbox的存在。
　　通過亞細胞定位實驗發(fā)現(xiàn)，內源BRSK2蛋白在有絲分裂期與γ-tubulin共定位。細胞阻滯和釋放實驗后都發(fā)現(xiàn)，BRSK2蛋白水平在G2/M期達到頂峰，G2/M期后逐漸下降，到G1/S又降至最低，結果表明BRSK2蛋白在細胞有絲分裂過程中是不穩(wěn)定的。細胞經蛋白酶體抑制劑處理后，BRSK2的蛋白水平顯著上調，而BRSK2的mRNA水平并沒有明顯的變化。實驗還證明，BRSK2能夠被

4、泛素化，且用MG132處理后，泛素化水平顯著增強。研究表明，不是APC/CCdc20，而是APC/CCdh1介導促進BRSK2蛋白的泛素化降解。干擾內源Cdh1后，引起B(yǎng)RSK2的蛋白水平上調。用放線菌酮處理細胞后，干擾內源Cdh1組的BRSK2蛋白半衰期比非干擾的對照組中的顯著延長。進一步實驗證明，在生理條件下，BRSK2與Cdh1相互作用，且在有絲分裂期亞細胞共定位，表明內源BRSK2與Cdh1在有絲分裂期形成復合體。經篩查發(fā)現(xiàn)，B

5、RSK2蛋白氨基序列中含有2個典型的D box和1個KEN box，通過物種間同源比對發(fā)現(xiàn)，這3個box是非常保守的。實驗鑒定BRSK2蛋白的降解是KEN box依賴的，而KEN box的突變增強了BRSK2蛋白的穩(wěn)定性。超表達野生型BRSK2和KEN box突變體均能引起細胞G2/M期細胞增多。因此，我們首次發(fā)現(xiàn)并證明BRSK2通過泛素-蛋白酶體途徑來調控細胞周期的進程。
　　本文的第二部分還初步研究了新基因C19orf66的生

6、物學功能。C19orf66蛋白屬于UPF0515蛋白家族，資料顯示，C19orf66基因在進化歷史進程中，到半脊索海生生物Saccoglossus kowalevskii時開始出現(xiàn)。迄今為止，對于C19orf66的功能研究仍然很有限。有基因芯片數(shù)據(jù)顯示，C19orf66在腦癌，肺癌等多種腫瘤組織中下調表達。根據(jù)已有的信息提示，我們開始對C19orf66進行初步的功能研究。C19orf66基因位于19號染色體上，基因全長2139bp，其開

7、放閱讀框（ORF）編碼291個氨基酸。C19orf66基因定位在19p13.2，由7個外顯子和6個內含子組成。對同源基因進行比對后發(fā)現(xiàn)，C19orf66基因在脊椎動物中有很高的同源性。RT-PCR分析顯示，C19orf66在人的不同組織中均有表達。在HeLa細胞中的亞細胞定位分析表明，C19orf66主要定位于細胞質中。通過信號通路研究發(fā)現(xiàn)，C19orf66顯著下調Rb通路的活性。進一步研究發(fā)現(xiàn)，超表達和消減C19orf66均可促進腫瘤