人源DNA聚合酶Polδ小亞基p50與PCNA的互作反應(yīng)分析.pdf

1、真核生物DNA聚合酶δ(DNA polymerase δ,Polδ)是由四個亞基構(gòu)成的異源四聚體,它是染色體DNA復(fù)制過程中最主要的復(fù)制酶,并在參與其它多種形式DNA修復(fù)過程中起著關(guān)鍵作用。真核生物Polδ由以下四個亞基組成:催化大亞基p125,與小亞基p50緊緊捆綁而構(gòu)成核心酶p125/p50;第三亞基p68(又被稱為調(diào)節(jié)亞基),是一個增殖細胞核抗原PCNA(Proliferating Cell Nuclear Antigen,PCN

2、A)的捆綁蛋白;以及第四亞基p12。作為染色體DNA復(fù)制酶功能時的Polδ在介導DNA合成時主要依賴于與PCNA及其它相關(guān)復(fù)制蛋白復(fù)合物之間的綜合作用,此時,PCNA作為一個分子滑動夾環(huán)(sliding clamp)在起作用。
　　 在參與DNA復(fù)制時,PCNA呈現(xiàn)為一種環(huán)狀分子滑動夾環(huán)的三聚體復(fù)合物結(jié)構(gòu),這種滑動夾環(huán)可以捆綁住DNA聚合酶并結(jié)合到它們的脫氧核苷酸底物上,保證高度持續(xù)合成過程的進行,并且,PCNA在協(xié)調(diào)DNA復(fù)制

3、和修復(fù)過程中所涉及到的一些蛋白募集一離散過程中也起著非常重要的作用。盡管有極少數(shù)的保守序列,但是環(huán)形持續(xù)合成夾環(huán)還是共有一個相似的具有六重區(qū)域?qū)ΨQ軸的拓撲結(jié)構(gòu)。Polδ的四個亞基(p125,p50,p68,p12)均被報道過可以與PCNA起捆綁反應(yīng),然而,對直接與PCNA反應(yīng)的Polδ亞基的特性以及各亞基如何通過與PCNA的反應(yīng)而影響Polδ的酶學特性仍然存在爭議。過去提出的Polδ-PCNA復(fù)合物的蛋白-蛋白之間反應(yīng)的網(wǎng)狀系統(tǒng)模型表明

4、Polδ能夠通過Polδ的三個亞基(p125,p68,p12)與三聚體PCNA的各單分子進行反應(yīng),但不包括小亞基p50。那么,p50是否也與PCNA起捆綁反應(yīng),這種反應(yīng)是如何影響Polδ-PCNA復(fù)合物結(jié)構(gòu),進而影響Polδ的酶學特性,這些問題亟待通過相關(guān)實驗來解決。
　　 本研究應(yīng)用遠端免疫印跡,定量酶聯(lián)免疫,亞細胞共定位等方法,證實:人源DNA聚合酶Polδ的小亞基p50確實能夠與PCNA起捆綁反應(yīng),但相對于其它三個亞基,p

5、50與PCNA的捆綁反應(yīng)相對較弱。因此,p50也是Polδ亞裝配與PCNA同源三聚體相互作用必不可少的一個媒介,Polδ實質(zhì)上是通過它的四個亞基與PCNA同源三聚體互作反應(yīng)而形成Polδ-PCNA復(fù)合物。根據(jù)以上實驗結(jié)果,本論文提出了一個新的PCNA-Polδ網(wǎng)狀系統(tǒng)反應(yīng)假想模型,該模型以Polδ各亞基分別與PCNA同源三聚體的單個PCNA分子發(fā)生一價反應(yīng)為假設(shè),在形成Polδ-PCNA蛋白復(fù)合物過程中,Polδ四個亞基均參與了與PCN

6、A的反應(yīng)。
　　 癌癥是一種由遺傳和表觀遺傳改變,以細胞異常增殖及轉(zhuǎn)移為特點的一大類疾病,而DNA聚合酶Polδ在維持細胞周期的正常調(diào)節(jié)以保證基因組結(jié)構(gòu)的完整性和遺傳穩(wěn)定性方面具有的特殊生物學功能。明確Polδ-PCNA復(fù)合物結(jié)構(gòu),進一步闡明這種復(fù)合物在DNA復(fù)制及各種DNA損傷修復(fù)過程中所扮演的角色,對今后從人類癌癥發(fā)病的起因揭示:由于Polδ功能改變,使得遺傳基因組不穩(wěn)定,進而導致腫瘤發(fā)生的機制具有十分重要的意義。同時,本研