人食管癌組織DNA聚合酶β基因啟動子突變的研究.pdf

1、背景與目的:
　　 食管癌（esophageal carcinoma）是我國常見高發(fā)的惡性腫瘤，在我國居惡性腫瘤的第4位。食管癌的生存率很低，75％病人在診斷后一年內(nèi)死亡，5年生存率僅為5-10％。許多種類基因可能與食管癌癌變相關(guān)聯(lián)，包括參與酒精代謝、葉酸代謝、致癌物代謝、DNA修復和細胞周期調(diào)控的基因以及致癌基因。但其確切的發(fā)病機制仍未闡明。因此揭示食管癌發(fā)生的分子機制，為從基因水平上防治該病具有重要的理論意義和實用價值。

2、r>　　 從本質(zhì)上說腫瘤是基因病，其發(fā)生、發(fā)展過程是多種基因表達失常的結(jié)果。因此，真正意義上的腫瘤治療應以修復這些發(fā)生變化的基因為基點。內(nèi)源性代謝過程改變或環(huán)境致癌物質(zhì)均可誘發(fā)DNA損傷。正常情況下，體內(nèi)DNA修復系統(tǒng)保證生命系統(tǒng)的正常運行，它可以修復各種原因引發(fā)的DNA損傷并能即時校讀DNA復制過程中的堿基錯配。反之，如果DNA損傷修復基因一旦發(fā)生了突變和/或表達異常，可導致其功能異常改變，使損傷的DNA得不到及時修復造成突變基因累

3、積而增加基因組不穩(wěn)定性，細胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。因此，DNA修復酶的正常功能對消除DNA損傷至關(guān)重要。已經(jīng)證明，DNA修復能力的降低與患癌的風險增加有關(guān)。DNA修復基因中的基因多態(tài)性可使DNA修復能力發(fā)生改變，這可能與包括食管癌在內(nèi)的患癌的風險性有關(guān)。
　　 DNA聚合酶β（DNA polymerase beta，polβ）在脊椎動物細胞內(nèi)是一個基本表達的堿基切除修復的關(guān)鍵酶，屬于看家基因，有14個外顯子及13個內(nèi)含子，轉(zhuǎn)錄1.4kb

4、 mRNA。其基因5’區(qū)約-100bp左右的核心啟動子序列是調(diào)節(jié)基因表達的重要序列，該區(qū)域有重要的調(diào)控元件可維持啟動子的絕大部分活性。近年來許多學者已在胃癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、膀胱癌、前列腺癌等多種人類腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)polβ的基因突變和/或表達異常。有研究結(jié)果提示polβ基因的突變和高表達可能與食管癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。但是關(guān)于polβ基因啟動子對表達的調(diào)控機制以及在癌癥發(fā)生發(fā)展中的作用仍不明確，在國內(nèi)外文獻中尚未見到關(guān)于食管癌中DNA po

5、lβ基因啟動子突變、及突變對其啟動子活性與基因表達影響的研究報道。啟動子能啟動基因轉(zhuǎn)錄，也是基因表達水平的重要調(diào)控環(huán)節(jié)。設想如果基因啟動子核心區(qū)域出現(xiàn)堿基變異，則可使啟動子的活性發(fā)生改變，進而導致其基因表達產(chǎn)物的活性與含量的改變。因此，對啟動子的深入研究將有助于深入了解其基因的功能。
　　 本研究采用分子生物學方法，對25例食管癌患者食管癌組織及相對應的癌旁和正常粘膜組織中的DNA polβ基因啟動子的突變狀況進行檢測和分析；利

6、用螢光素酶報告基因系統(tǒng)對檢出的突變型polβ基因啟動子進行轉(zhuǎn)錄活性分析；構(gòu)建含野生型polβ基因啟動子的polβ基因表達單元和具有上調(diào)轉(zhuǎn)錄活性的含突變型polβ基因啟動子的polβ基因表達單元，利用慢病毒載體系統(tǒng)將其整合入polβ基因敲除的EC9706細胞，測定polβ的mRNA和蛋白表達水平，探討分析突變型polβ啟動子對靶基因polβ表達的影響。
　　 第一部分：人食管癌組織DNA polβ基因啟動子的克隆及突變檢測分析。<

7、br>　　 第二部分：含野生型/突變型polβ啟動子的螢光素酶報告基因載體的構(gòu)建及不同突變位點對啟動子活性的影響。
　　 第三部分：含野生型/突變型polβ啟動子的polβ慢病毒表達載體構(gòu)建及polβ啟動子突變對其靶基因表達的影響。
　　 結(jié)論：
　　 1.揭示了食管癌組織、癌旁組織和正常粘膜組織中DNA polβ基因啟動子存在突變；發(fā)現(xiàn)35處突變位點，16種突變類型的組合方式，21種突變形式，其中-37位C→

8、A和-65位G→T是出現(xiàn)頻率最高的突變熱點。食管癌組織中DNA polβ基因啟動子突變位點主要集中在其啟動子核心區(qū)域。polβ啟動子在食管癌癌，癌旁和正常粘膜組織中的突變率差異無統(tǒng)計學意義，提示polβ基因啟動子變異不僅發(fā)生在癌變之后，而且極有可能發(fā)生在食管癌癌變之前。
　　 2.來源于食管癌組織的含突變型DNA polβ基因啟動子的螢光素酶平均轉(zhuǎn)錄活性顯著高于來源于癌旁和正常粘膜組織的突變型啟動子的轉(zhuǎn)錄活性。正常粘膜組織中的M

9、6“-37位C→A、30位T→C”，M9“-79位T→C、-65位G→T”，M12“-19位缺失C”突變型的polβ基因啟動子轉(zhuǎn)錄活性與野生型比較無差異。表明食管癌組織中的polβ基因啟動子的突變位點和形式的組合方式可上調(diào)DNA polβ基因啟動子的轉(zhuǎn)錄活性。
　　 3.證實在食管癌細胞中，M2突變型“-65位G→T、89位T→C”和M11突變型“-37位C→A”的polβ啟動子突變位點，可導致polβ基因表達上調(diào)，使polβ過