人食管癌組織DNA聚合酶β基因啟動(dòng)子突變的研究.pdf

1、背景與目的:
　　 食管癌（esophageal carcinoma）是我國(guó)常見(jiàn)高發(fā)的惡性腫瘤，在我國(guó)居惡性腫瘤的第4位。食管癌的生存率很低，75％病人在診斷后一年內(nèi)死亡，5年生存率僅為5-10％。許多種類(lèi)基因可能與食管癌癌變相關(guān)聯(lián)，包括參與酒精代謝、葉酸代謝、致癌物代謝、DNA修復(fù)和細(xì)胞周期調(diào)控的基因以及致癌基因。但其確切的發(fā)病機(jī)制仍未闡明。因此揭示食管癌發(fā)生的分子機(jī)制，為從基因水平上防治該病具有重要的理論意義和實(shí)用價(jià)值。

2、r>　　 從本質(zhì)上說(shuō)腫瘤是基因病，其發(fā)生、發(fā)展過(guò)程是多種基因表達(dá)失常的結(jié)果。因此，真正意義上的腫瘤治療應(yīng)以修復(fù)這些發(fā)生變化的基因?yàn)榛c(diǎn)。內(nèi)源性代謝過(guò)程改變或環(huán)境致癌物質(zhì)均可誘發(fā)DNA損傷。正常情況下，體內(nèi)DNA修復(fù)系統(tǒng)保證生命系統(tǒng)的正常運(yùn)行，它可以修復(fù)各種原因引發(fā)的DNA損傷并能即時(shí)校讀DNA復(fù)制過(guò)程中的堿基錯(cuò)配。反之，如果DNA損傷修復(fù)基因一旦發(fā)生了突變和/或表達(dá)異常，可導(dǎo)致其功能異常改變，使損傷的DNA得不到及時(shí)修復(fù)造成突變基因累

3、積而增加基因組不穩(wěn)定性，細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。因此，DNA修復(fù)酶的正常功能對(duì)消除DNA損傷至關(guān)重要。已經(jīng)證明，DNA修復(fù)能力的降低與患癌的風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)。DNA修復(fù)基因中的基因多態(tài)性可使DNA修復(fù)能力發(fā)生改變，這可能與包括食管癌在內(nèi)的患癌的風(fēng)險(xiǎn)性有關(guān)。
　　 DNA聚合酶β（DNA polymerase beta，polβ）在脊椎動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)是一個(gè)基本表達(dá)的堿基切除修復(fù)的關(guān)鍵酶，屬于看家基因，有14個(gè)外顯子及13個(gè)內(nèi)含子，轉(zhuǎn)錄1.4kb

4、 mRNA。其基因5’區(qū)約-100bp左右的核心啟動(dòng)子序列是調(diào)節(jié)基因表達(dá)的重要序列，該區(qū)域有重要的調(diào)控元件可維持啟動(dòng)子的絕大部分活性。近年來(lái)許多學(xué)者已在胃癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、膀胱癌、前列腺癌等多種人類(lèi)腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)polβ的基因突變和/或表達(dá)異常。有研究結(jié)果提示polβ基因的突變和高表達(dá)可能與食管癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。但是關(guān)于polβ基因啟動(dòng)子對(duì)表達(dá)的調(diào)控機(jī)制以及在癌癥發(fā)生發(fā)展中的作用仍不明確，在國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)中尚未見(jiàn)到關(guān)于食管癌中DNA po

5、lβ基因啟動(dòng)子突變、及突變對(duì)其啟動(dòng)子活性與基因表達(dá)影響的研究報(bào)道。啟動(dòng)子能啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄，也是基因表達(dá)水平的重要調(diào)控環(huán)節(jié)。設(shè)想如果基因啟動(dòng)子核心區(qū)域出現(xiàn)堿基變異，則可使啟動(dòng)子的活性發(fā)生改變，進(jìn)而導(dǎo)致其基因表達(dá)產(chǎn)物的活性與含量的改變。因此，對(duì)啟動(dòng)子的深入研究將有助于深入了解其基因的功能。
　　 本研究采用分子生物學(xué)方法，對(duì)25例食管癌患者食管癌組織及相對(duì)應(yīng)的癌旁和正常粘膜組織中的DNA polβ基因啟動(dòng)子的突變狀況進(jìn)行檢測(cè)和分析；利

6、用螢光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)對(duì)檢出的突變型polβ基因啟動(dòng)子進(jìn)行轉(zhuǎn)錄活性分析；構(gòu)建含野生型polβ基因啟動(dòng)子的polβ基因表達(dá)單元和具有上調(diào)轉(zhuǎn)錄活性的含突變型polβ基因啟動(dòng)子的polβ基因表達(dá)單元，利用慢病毒載體系統(tǒng)將其整合入polβ基因敲除的EC9706細(xì)胞，測(cè)定polβ的mRNA和蛋白表達(dá)水平，探討分析突變型polβ啟動(dòng)子對(duì)靶基因polβ表達(dá)的影響。
　　 第一部分：人食管癌組織DNA polβ基因啟動(dòng)子的克隆及突變檢測(cè)分析。<

7、br>　　 第二部分：含野生型/突變型polβ啟動(dòng)子的螢光素酶報(bào)告基因載體的構(gòu)建及不同突變位點(diǎn)對(duì)啟動(dòng)子活性的影響。
　　 第三部分：含野生型/突變型polβ啟動(dòng)子的polβ慢病毒表達(dá)載體構(gòu)建及polβ啟動(dòng)子突變對(duì)其靶基因表達(dá)的影響。
　　 結(jié)論：
　　 1.揭示了食管癌組織、癌旁組織和正常粘膜組織中DNA polβ基因啟動(dòng)子存在突變；發(fā)現(xiàn)35處突變位點(diǎn)，16種突變類(lèi)型的組合方式，21種突變形式，其中-37位C→

8、A和-65位G→T是出現(xiàn)頻率最高的突變熱點(diǎn)。食管癌組織中DNA polβ基因啟動(dòng)子突變位點(diǎn)主要集中在其啟動(dòng)子核心區(qū)域。polβ啟動(dòng)子在食管癌癌，癌旁和正常粘膜組織中的突變率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示polβ基因啟動(dòng)子變異不僅發(fā)生在癌變之后，而且極有可能發(fā)生在食管癌癌變之前。
　　 2.來(lái)源于食管癌組織的含突變型DNA polβ基因啟動(dòng)子的螢光素酶平均轉(zhuǎn)錄活性顯著高于來(lái)源于癌旁和正常粘膜組織的突變型啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性。正常粘膜組織中的M

9、6“-37位C→A、30位T→C”，M9“-79位T→C、-65位G→T”，M12“-19位缺失C”突變型的polβ基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性與野生型比較無(wú)差異。表明食管癌組織中的polβ基因啟動(dòng)子的突變位點(diǎn)和形式的組合方式可上調(diào)DNA polβ基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性。
　　 3.證實(shí)在食管癌細(xì)胞中，M2突變型“-65位G→T、89位T→C”和M11突變型“-37位C→A”的polβ啟動(dòng)子突變位點(diǎn)，可導(dǎo)致polβ基因表達(dá)上調(diào)，使polβ過(guò)