人源Polδ最小亞基p12 Calpain酶解位點(diǎn)分析及泛素化修飾E2-E3確定.pdf

1、由四個(gè)亞基構(gòu)成的真核生物DNA聚合酶δ(DNA polymeraseδ，Polδ)是染色體DNA復(fù)制過程中最主要的復(fù)制酶之一，同時(shí)，它還通過缺口填補(bǔ)和重新合成DNA的方式，在參與多種形式DNA修復(fù)過程中起著關(guān)鍵作用。
　　通過對(duì)人源Polδ的深入研究，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)Polδ是一個(gè)DNA損傷響應(yīng)的靶目標(biāo)，通過射線誘導(dǎo)或者遺傳毒物處理體外培養(yǎng)的人源細(xì)胞，在引起DNA損傷的情況下，Polδ的最小亞基p12能夠在ATR/Chk1通路調(diào)控下以泛

2、素化依賴的形式降解，從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Polδ由原來的四聚體形式Polδ4轉(zhuǎn)換為三聚體Polδ3以應(yīng)對(duì)DNA損傷。但到目前為止，對(duì)p12在ATR/Chk1通路調(diào)控下被降解（下調(diào)）的泛素修飾機(jī)制不清楚，因?yàn)橐獜谋姸嗟腅3中確定出特異性識(shí)別和介導(dǎo)p12進(jìn)行泛素化修飾的連接酶E3，以及尋找E2/E3系統(tǒng)調(diào)控p12泛素化修飾途徑是一項(xiàng)工作量較為龐大的實(shí)驗(yàn)。本研究組最新研究還發(fā)現(xiàn)，通過細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)試劑或相關(guān)誘導(dǎo)藥物等處理宮頸癌HeLa細(xì)胞，在鈣離子誘

3、導(dǎo)激活Calpain途徑的HeLa細(xì)胞凋亡過程中，p12亞基能夠被Calpain所降解，揭示了Polδ在參與細(xì)胞凋亡過程中的新功能，但對(duì)Calpain蛋白是如何識(shí)別并酶解p12的機(jī)制并不清楚。
　　針對(duì)以上問題，本論文研究首先擬構(gòu)建五個(gè)帶GST標(biāo)簽的p12融合蛋白片段D1-D5，建立Calpain酶解p12的體外反應(yīng)體系，通過分析那個(gè)片段能夠被Calpain所酶解，對(duì)p12被μ-Calpain降解的酶解位點(diǎn)進(jìn)行定位;同時(shí)，通過建立

4、p12泛素化修飾體外反應(yīng)系統(tǒng)，結(jié)合質(zhì)譜分析聯(lián)用，將體外培養(yǎng)的HeLa細(xì)胞抽提物經(jīng)過四個(gè)不同性質(zhì)的層析柱進(jìn)行分離純化，以查找能夠特異性識(shí)別p12的E3鏈激酶，并確定介導(dǎo)p12多泛素化反應(yīng)E2/E3調(diào)控系統(tǒng)。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，只有p12的D2和D3片段能夠被μ-Calpain所降解，通過比較GST和GST-p12對(duì)照組的酶解反應(yīng)情況，經(jīng)分析，初步確定酶解位點(diǎn)可能位于D2和D3之間一段重疊的氨基酸序列，即:28LAPELGEEPQPR

5、DEEE43;大規(guī)模查找特異性識(shí)別靶蛋白p12的E3和E2/E3調(diào)控系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)表明，唯一能夠特異性識(shí)別p12的E3鏈激酶為RNF8;而介導(dǎo)p12多泛素化反應(yīng)的E2/E3調(diào)控系統(tǒng)被確定為UbcH13/Uev1a/RNF8。
　　本論文研究對(duì)闡明Calpain降解p12的酶解機(jī)制，以p12/Polδ在依賴Calpain激活途徑細(xì)胞調(diào)亡中過程作為一個(gè)潛在的重要靶標(biāo)，針對(duì)某種特定的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行化療藥效的快速評(píng)估，具重要的理論參考和潛在的實(shí)