DNA和蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物光學(xué)分析新方法.pdf

1、生物大分子是構(gòu)成生命的基礎(chǔ)物質(zhì)，主要包括蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)和糖四大類，其中蛋白質(zhì)和核酸是生命科學(xué)中最重要的兩類生物大分子。單核苷酸多態(tài)性(SNPs)是一種常見且可穩(wěn)定遺傳的基因變異，能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生許多遺傳疾病，而人體內(nèi)各種蛋白質(zhì)含量的變化直接反映了人體的新陳代謝情況，這些已成為疾病診斷的主要依據(jù)。因此，針對生物體內(nèi)的標(biāo)志性生物大分子蛋白質(zhì)和核酸的檢測、分析在生命科學(xué)和生物醫(yī)學(xué)研究以及疾病的臨床診斷領(lǐng)域具有十分重要的科學(xué)意義。許多的早期診斷

2、都是基于熒光光譜、熒光各向異性、熒光共振能量轉(zhuǎn)移以及表面等離子共振等的測量實現(xiàn)的。盡管以上這些技術(shù)非常重要，發(fā)展高特異性、高靈敏度且穩(wěn)健、易操作、低成本的蛋白質(zhì)和核酸分析方法與技術(shù)一直是分析化學(xué)研究的重要內(nèi)容，是分析科學(xué)家們不懈追求的奮斗目標(biāo)?；诠庾V或者發(fā)光的檢測技術(shù)由于具有靈敏度高、操作簡便、檢測成本低、所需儀器簡單以及易于實現(xiàn)微型化等特點，使得以光化學(xué)檢測為基礎(chǔ)的生物分析技術(shù)具有極其廣闊的應(yīng)用前景。為此，本研究論文我們發(fā)展了幾種基

3、于光化學(xué)的基因分型技術(shù)、DNA檢測技術(shù)以及蛋白質(zhì)分析方法：
　　 (1)建立了一種基于連接酶介導(dǎo)鏈置換放大一脫氧核酶催化均相免標(biāo)記化學(xué)發(fā)光的基因分型新方法。該方法利用連接酶對錯配的高特異性識別，僅將與目標(biāo)基因完全互補的探針共價連接。在具有強鏈置換能力的聚合酶及切刻酶的共同作用下，該連接產(chǎn)物3’端的發(fā)夾結(jié)構(gòu)自發(fā)啟動聚合酶延伸反應(yīng)，在近5’端獲得完整的切刻酶識別位點，從而介導(dǎo)切刻酶切割、聚合酶延伸以及鏈置換釋放的恒溫鏈置換放大反應(yīng)。

4、被釋放的第一級放大產(chǎn)物會與另一鏈置換放大反應(yīng)模板雜交，引發(fā)第二級鏈置換放大反應(yīng)，釋放大量的血紅素適配體。該適配體與血紅素結(jié)合后，催化魯米諾－雙氧水反應(yīng)而產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光信號。據(jù)此判定目標(biāo)基因與探針是否在多態(tài)性位點發(fā)生錯配，從而可實現(xiàn)目標(biāo)基因的基因型的鑒定。該方法采用具有很好的特異性，很高的靈敏度，使其檢測限可達(dá)0.1 fM，可直接應(yīng)用與基因組的檢測。同時還具有很高的信背比(150倍)與較寬的動態(tài)響應(yīng)范圍(1 fM至1 nM)。而且，該方法可

5、完全在均相中實現(xiàn)，操作簡便，易于自動化與高通量化，因此可望在基因組研究與分子診斷領(lǐng)域方面具有一定的應(yīng)用前景。
　　 (2)發(fā)展了一種基于高溫連接酶檢測反應(yīng)介導(dǎo)的鏈置換放大--脫氧核酶催化化學(xué)發(fā)光的免標(biāo)記基因分型新方法用于細(xì)胞色素C P4502D6*10的基因分型。該方法針利用高溫連接酶對錯配的高特異性識別，在進(jìn)行退火連接－變性解鏈的熱循環(huán)過程中，僅將3’端與目標(biāo)基因完全互補的探針對共價連接，產(chǎn)生大量的連接產(chǎn)物。在具有強鏈置換能力

6、的聚合酶及切刻酶的共同作用下，具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的連接產(chǎn)物的3’端自發(fā)延伸，介導(dǎo)切刻酶切割、聚合酶延伸以及恒溫鏈置換反應(yīng)，進(jìn)行第二步擴增，釋放大量的血紅素適配體。該適配體與血紅素結(jié)合形成具有辣根過氧化酶催化活性的復(fù)合物，催化魯米諾－雙氧水反應(yīng)產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光信號，從而實現(xiàn)對目標(biāo)基因的基因型的鑒定。該方法采用具有高忠實性的高溫DNA連接酶進(jìn)行等位基因的判別，保證了分型方法的高特異性。同時，由于引入了線性恒溫鏈置換反應(yīng)，進(jìn)一步提高了方法的靈敏度，使其

7、檢測限可達(dá)0.1 pM。由于結(jié)合血紅素適配體的催化化學(xué)發(fā)光進(jìn)行信號轉(zhuǎn)換，該法獲得了57倍的較高信背比，同時具有1 pM至1 nM的較寬動態(tài)響應(yīng)范圍。由于該方法可完全在均相中實現(xiàn)，重現(xiàn)性好，同時無需標(biāo)記，成本低廉，又操作簡便，易于自動化與高通量化，因此可望在藥理基因組研究與分子診斷領(lǐng)域方面具有一定的應(yīng)用前景。
　　 (3)提出了一種基于連接酶鏈反應(yīng)的通用PCR－生物編碼色譜多位點同時檢測的基因分型新方法。該方法針對目標(biāo)DNA設(shè)計了

8、一對等位特異性區(qū)分探針和一條通用探針，具有高特異性識別能力的連接酶僅將與目標(biāo)DNA完全互補的探針對共價連接。以此連接產(chǎn)物為擴增模版，加入熒光標(biāo)記的通用引物進(jìn)行PCR擴增，從而獲得大量熒光標(biāo)記的含有生物編碼序列和完整限制性內(nèi)切酶識別序列的擴增產(chǎn)物。經(jīng)過限制性內(nèi)切酶處理，將目標(biāo)DNA的基因型鏈轉(zhuǎn)化為預(yù)先設(shè)計的生物編碼序列，再采用離子對反相高效液相色譜進(jìn)行分離與同時檢測。該技術(shù)顯著地提高了目標(biāo)DNA分子的檢測靈敏度和準(zhǔn)確性。已采用該新方法對兩

9、個位點的不同基因突變情況成功地進(jìn)行了同時基因分型，檢測下限為0.1 fM。
　　 (4)設(shè)計了一種基于循環(huán)酶切原理的光化學(xué)生物傳感技術(shù)用于靶核酸的簡單，靈敏與快速的分析與檢測。該方法設(shè)計了一條3’端修飾有熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)的雙標(biāo)探針。若靶核酸存在，該探針與其雜交形成完全匹配的雙鏈，從而啟動核酸外切酶Ⅲ介導(dǎo)的循環(huán)酶切過程，水解掉雙鏈雜交體中的雙標(biāo)探針，促使熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分離，產(chǎn)生熒光信號，而未被水解的靶核酸繼續(xù)參與下一個酶切循

10、環(huán)，進(jìn)而實現(xiàn)對靶核酸的循環(huán)放大檢測。模擬靶序列實驗證明，該方法還具有一定的堿基錯配的區(qū)分能力。在50 pM－750 pM靶核酸濃度范圍內(nèi)，該方法具有較好的動態(tài)響應(yīng)，檢測下限為0.1 pM。
　　 (5)構(gòu)建了一種基于巢式PCR－生物編碼色譜的品系特異性轉(zhuǎn)基因玉米多靶標(biāo)同時檢測新方法。該方法針對目標(biāo)DNA設(shè)計了一對目標(biāo)特異性探針，在目標(biāo)基因存在的情況下，經(jīng)第一階段幾個擴增循環(huán)產(chǎn)生少量PCR擴增產(chǎn)物；以第一階段的PCR產(chǎn)物為擴增模板

11、，加入熒光標(biāo)記的通用引物進(jìn)行第二階段的通用PCR擴增，從而獲得大量熒光標(biāo)記的含有生物編碼序列和完整限制性內(nèi)切酶識別序列的擴增產(chǎn)物。經(jīng)過限制性內(nèi)切酶處理，將目標(biāo)DNA的基因型鏈轉(zhuǎn)化為預(yù)先設(shè)計的生物編碼序列，再采用離子對反相高效液相色譜進(jìn)行分離與同時檢測。該技術(shù)顯著地提高了目標(biāo)DNA分子的檢測靈敏度和準(zhǔn)確性。已采用該新方法對四個模擬靶標(biāo)序列成功地進(jìn)行了同時檢測分析，檢測下限為0.01 fM。
　　 (6)開發(fā)了一種基于熒光保護(hù)分析原

12、理的均相適配體傳感技術(shù)用于蛋白的分析檢測。該技術(shù)利用熒光素標(biāo)記的適配體與其受體蛋白結(jié)合，抑制熒光素抗體誘導(dǎo)的熒光淬滅，從而實現(xiàn)對受體蛋白的定量檢測。以免疫球蛋白IgE為模型蛋白的驗證實驗證明該方法具有較高的靈敏度；血清中共存蛋白的干擾實驗，證明該方法也具有很好的抗干擾能力，即具有很高的特異性。采用不同的熒光標(biāo)記基團(tuán)以及相應(yīng)的抗體，還可以利用該方法對多蛋白進(jìn)行同時分析，實現(xiàn)高通量檢測的目標(biāo)。在0.1－50 nM濃度范圍內(nèi)，該適配體傳感器具