鈣離子介導(dǎo)線粒體損傷在熱打擊誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡中的作用.pdf

1、背景和目的:
　　中暑(heat stroke)是指暴露在高溫環(huán)境中，機(jī)體未能作出適應(yīng)性調(diào)節(jié)而產(chǎn)生的一系列急性疾病的統(tǒng)稱，也稱為急性熱致疾病(Heat-related illness)，主要表現(xiàn)為熱痙攣、熱暈厥、熱衰竭等，嚴(yán)重時可發(fā)展為重癥中暑，直接威脅人們的生命。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2003年歐洲夏季熱浪期間，有超過約45000人死亡，其中三分之一死亡的直接原因是由中暑引起，為歐洲歷史上近100年來最嚴(yán)重的十大自然災(zāi)難之一。近年來，隨著全球

2、氣候變暖以及熱浪襲擊的頻率和強(qiáng)度增加，中暑的發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢，并對公眾健康形成災(zāi)害性影響。而目前對于重癥中暑發(fā)病過程中導(dǎo)致組織和細(xì)胞損傷的病理機(jī)制尚不清楚，因而缺乏特殊、有效的早期臨床治療措施，這也是導(dǎo)致重癥中暑患者救治時間長、死亡率高的重要原因。因此，研究重癥中暑所致多器官功能障礙綜合征(Multipleorgan dysfunction syndrome，MODS)的病理生理機(jī)制，可為重癥中暑的救治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和新思路，

3、對降低其致死、致殘率都十分重要。
　　VEC損傷作為中暑發(fā)病過程中一個突出特點(diǎn)，在中暑發(fā)病機(jī)制中起著重要作用。細(xì)胞以及動物實(shí)驗(yàn)研究顯示，熱打擊可引起內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生廣泛凋亡，提示VEC凋亡可能是機(jī)體由熱應(yīng)激的生理進(jìn)程向重癥中暑的病理進(jìn)程轉(zhuǎn)變的重要中間環(huán)節(jié)。我們前期臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，重癥中暑患者存在嚴(yán)重的血管內(nèi)皮細(xì)胞VEC損傷，主要表現(xiàn)在外周血循環(huán)血管內(nèi)皮細(xì)胞(circulation endothelia cells，CEC)數(shù)量明顯升高;

4、進(jìn)一步體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，建立了熱打擊人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)，發(fā)現(xiàn)熱打擊對HUVEC細(xì)胞具有細(xì)胞毒效應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞增殖受到抑制，并對高熱誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷機(jī)制進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)熱打擊早期即誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)Ca2+失穩(wěn)并介導(dǎo)P53快速移位至細(xì)胞線粒體，激活了線粒體凋亡通路，從而誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞廣泛凋亡;但在熱打擊過程中如何引起Ca2+失穩(wěn)，以及其中可能存在的機(jī)制并沒有

5、闡述，因此，高熱所致的內(nèi)皮損傷的凋亡機(jī)制仍有待于進(jìn)一步深入研究，本課題最終可為揭示中暑時VEC介導(dǎo)的病理過程奠定基礎(chǔ)，為臨床預(yù)防及治療中暑提供理論依據(jù)。
　　主要方法和結(jié)果:
　　1.熱打擊對HUVEC細(xì)胞具有直接細(xì)胞毒效應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞DNA損傷及凋亡
　　收集對照組(37℃)及熱打擊組(39℃、41℃、43℃、45℃)細(xì)胞，采用水溶性四唑鹽(WST-1)法和乳酸脫氫酶(LDH)法檢測熱打擊對細(xì)胞損傷的影響，評價熱打擊對

6、細(xì)胞的毒效應(yīng)。與對照組37℃比較，隨著熱打擊溫度增高(41℃～45℃)，細(xì)胞活力呈現(xiàn)進(jìn)行性下降;細(xì)胞的LDH釋放呈溫度依懶性增高。使用Hoechst33258熒光染色檢測熱打擊后細(xì)胞凋亡情況，同樣發(fā)現(xiàn)隨著熱打擊溫度增高(41℃～43℃)，HUVEC細(xì)胞出現(xiàn)典型的凋亡形態(tài)，表現(xiàn)為胞核固縮，致密深染，染色質(zhì)邊集，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見亮藍(lán)色強(qiáng)熒光，細(xì)胞凋亡呈熱打擊溫度依賴性增加。進(jìn)一步使用Caspase-3抑制劑Z-DEVD-FMK，發(fā)現(xiàn)其可以明顯抑

7、制熱打擊誘導(dǎo)的凋亡，表現(xiàn)為41℃+Z-DEVD-FMK組及43℃+Z-DEVD-FMK組HUVEC細(xì)胞內(nèi)亮藍(lán)色強(qiáng)熒光的凋亡細(xì)胞較之前明顯減少。
　　為明確高熱對HUVEC細(xì)胞凋亡的影響并深入探索這其中可能存在的機(jī)制，我們選擇43℃(熱打擊2h)作為研究溫度，觀察熱打擊后不同復(fù)溫時間點(diǎn)(0h、1h、3h、6h、9h)細(xì)胞凋亡表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)HUVEC細(xì)胞在43℃熱打擊2h后，復(fù)溫3h時開始激活Caspase-3活性、PARP表達(dá)及DN

8、A損傷，并在復(fù)溫6h時達(dá)到高峰，一直持續(xù)至9h，表明高熱可誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞凋亡，且呈復(fù)溫時間依賴性。
　　2.熱打擊誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞線粒體損傷，激活內(nèi)源性凋亡通路
　　為明確高熱是否對HUVEC細(xì)胞線粒體產(chǎn)生影響，我們通過電鏡觀察對照組及43℃熱打擊組細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)對照組(37℃)細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)基本正常;而熱打擊組(43℃)細(xì)胞線粒體腫脹，其雙層膜和嵴結(jié)構(gòu)消失，線粒體基質(zhì)均質(zhì)化改變（線粒體嵴溶解物、基質(zhì)及含染色質(zhì)物質(zhì)

9、相混合在一起形成致密均質(zhì)團(tuán)塊物），表明高熱對細(xì)胞線粒體具有損傷作用。
　　進(jìn)一步使用Caspase酶活性檢測試劑盒分析凋亡啟動蛋白Caspase-4、8、9的活化及Western Blot檢測GADD153、Apaf-1的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)熱打擊并沒有激活Caspase-4，8活性及GADD153蛋白的表達(dá)，而是特異的激活了Caspase-9及Apaf-1的表達(dá)，繼而活化Caspase-3，啟動Caspase的級聯(lián)反應(yīng)，引起細(xì)胞凋亡。

10、且Caspase-9及Apaf-1的表達(dá)呈復(fù)溫時間依賴性增強(qiáng)，在9h表達(dá)達(dá)到高峰，提示熱打擊可能通過線粒體損傷，激活了內(nèi)源性凋亡通路介導(dǎo)HUVEC細(xì)胞凋亡。為了進(jìn)一步證明熱打擊是通過激活內(nèi)源性凋亡介導(dǎo)HUVEC細(xì)胞凋亡，我們在HUVEC細(xì)胞過表達(dá)Bcl-xl，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)Bcl-xl后，HUVEC細(xì)胞Caspase-9及Apaf-1表達(dá)明顯減少，并且明顯抑制了Caspase的級聯(lián)反應(yīng)，由此確定熱打擊啟動了線粒體損傷相關(guān)的內(nèi)源性凋亡通路。<

11、br>　　3.熱打擊誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)Ca+失穩(wěn)介導(dǎo)線粒體損傷相關(guān)的凋亡通路
　　我們采用Ca2+敏感的熒光染料Flou-3AM，并且結(jié)合流式細(xì)胞技術(shù)分析了HUVEC細(xì)胞熱打擊后不同復(fù)溫時間點(diǎn)(0h、0.5h、1h、1.5h、2h)細(xì)胞內(nèi)Ca2+的變化，結(jié)果顯示:熱打擊后復(fù)溫0h細(xì)胞內(nèi)Ca+開始升高，2h達(dá)到高峰;同時，激活了下游的線粒體損傷相關(guān)的內(nèi)源性凋亡通路，表現(xiàn)為Caspase-9、Apaf-1的激活及Caspase-3、PARP的

12、活化;進(jìn)一步使用細(xì)胞可滲透的Ca2+螯合劑BAPTA-AM預(yù)處理細(xì)胞30min，熱打擊BAPTA-AM預(yù)處理過HUVEC細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)BAPTA-AM部分抑制了熱打擊誘導(dǎo)的內(nèi)源性凋亡通路，表現(xiàn)為Caspase-9、Apaf-1、Caspase-3和PARP的活化受抑。這一結(jié)果表明細(xì)胞內(nèi)Ca2+失穩(wěn)與熱打擊誘導(dǎo)線粒體損傷以及凋亡信號激活相關(guān)。
　　4.熱打擊誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、IP3R磷酸化介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)Ca2+失穩(wěn)
　　提取熱打擊后不同

13、復(fù)溫時間點(diǎn)(0、1、3、6、9h)和37℃對照組HUVEC細(xì)胞總蛋白，Western Blot分析內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶GRP78及未折疊蛋白反應(yīng)(UPR)相關(guān)蛋白P-PERK、P-eIF2a、ATF4的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，熱打擊0h時GRP78被激活，持續(xù)到熱打擊后3h左右，其后激活狀態(tài)逐漸被抑制;同樣，熱打擊復(fù)溫0h左右，PERK即被自我磷酸化而激活，隨后被逐漸抑制;eIF2a磷酸化發(fā)生在熱打擊后復(fù)溫1h左右，稍晚于PERK激活，

14、在1h左右達(dá)到高峰，并隨著復(fù)溫時間延長而逐漸下降;ATF4在3h左右表達(dá)增強(qiáng)，6h達(dá)高峰，隨后開始被抑制。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞內(nèi)的Ca2+儲存器，為了進(jìn)一步研究內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與細(xì)胞內(nèi)Ca2+失穩(wěn)的相關(guān)性，我們檢測了熱打擊后ER膜上三種與Ca2+攝入和釋放相關(guān)的蛋白(IP3R、RYR及SERCA)活化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)熱打擊后0h即誘導(dǎo)了IP3R磷酸化，并一直持續(xù)到9h，而熱打擊并沒有引起RYR及SERCA蛋白的改變;進(jìn)一步采用IP3R的特異性抑制劑Xest

15、ospongin B(XeB)預(yù)處理HUVEC細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)XeB可明顯抑制熱打擊后IP3R的磷酸化，同時明顯抑制Ca+的釋放。由此說明，在熱打擊早期即啟動了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，誘導(dǎo)UPR信號通路的激活(GRP78、PERK-eIF2a-ATF4)及IP3R相關(guān)的Ca2+通道的開放，介導(dǎo)了細(xì)胞內(nèi)Ca2+失穩(wěn)。
　　5.熱打擊誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞內(nèi)ROS爆發(fā)性釋放作為上游信號參與Ca2+失穩(wěn)介導(dǎo)的線粒體損傷相關(guān)的凋亡通路
　　收集熱打擊后不

16、同復(fù)溫時間點(diǎn)(0h、0.5h、1h、1.5h、2h)和37℃對照組HUVEC細(xì)胞，分別使用熒光探針DHE、DHR和DAF-FMDA標(biāo)記細(xì)胞，流式細(xì)胞儀和激光共聚焦顯微鏡檢測熱打擊后02-、H2O2和NO在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況。熱打擊主要誘導(dǎo)了02-和H2O2兩種自由基的升高，且熱打擊首先引起02-水平的變化，繼而引起H2O2升高，而對細(xì)胞內(nèi)NO水平?jīng)]有明顯影響。進(jìn)一步采用MnTBAP預(yù)處理HUVEC細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)MnTBAP可以明顯減輕熱打擊所

17、致的細(xì)胞毒效應(yīng)，提高HUVEC細(xì)胞活力;同時也明顯抑制熱打擊后HUVEC細(xì)胞內(nèi)02-水平、Ca2+失穩(wěn)、下游線粒體通路的Caspase-9、Apaf-1、Caspase-3、PARP蛋白表達(dá)以及DNA損傷;然而，當(dāng)我們使用Ca+特異性清除劑BAPTA-AM預(yù)處理HUVEC細(xì)胞時，發(fā)現(xiàn)其并不能抑制熱打擊所致的02-增高，表明在熱打擊引起細(xì)胞凋亡過程中，ROS作為上游產(chǎn)物參與了Ca2+介導(dǎo)的內(nèi)源性凋亡通路。
　　結(jié)論:
　　熱打