自噬在小鼠腦出血后腦損傷中的作用及機制研究.pdf

1、目的：自噬是一個涉及到細胞自身結(jié)構(gòu)通過溶酶體機制而被降解的過程,其中包括細胞器、衰老及錯誤折疊或破損的蛋白質(zhì)等。在不同的狀況下,自噬可以引起細胞的死亡,也可以促進細胞生存。研究表明,自噬在腦出血(intracerebral hemorrhage, ICH)后被激活。造成腦出血后繼發(fā)的神經(jīng)功能缺損的主要原因包括腦出血后腦血腫周邊腦水腫的形成和繼發(fā)的神經(jīng)細胞死亡。本研究中,我們分別應(yīng)用了自噬的抑制劑3-methyladenine(3-MA)

2、和誘導(dǎo)劑雷帕霉素(rapamycin,RAP)來調(diào)控自噬的水平,探索不同自噬水平對小鼠腦出血后腦損傷的作用,并通過對自噬和凋亡相關(guān)蛋白的監(jiān)測來探討自噬與凋亡的關(guān)系,以期為腦出血的治療提供新的方向。
　　方法：以ICR小鼠為實驗動物,采用在紋狀體部位注射膠原酶IV的方法建立ICH模型。在ICH前15min,小鼠側(cè)腦室給予自噬的抑制劑3-MA或激活劑雷帕霉素(RAP),并以等量的配制溶劑(DMSO與生理鹽水1:1混溶)注入側(cè)腦室作為對

3、照組;于ICH后1 d-7 d,應(yīng)用行為學(xué)試驗(Motor Test)評估ICH后各組試驗動物的運動功能;取ICH后24 h和72 h作為檢測時間點處死小鼠取全腦,用干-濕重法檢測腦出血側(cè)及對側(cè)紋狀體和腦皮質(zhì)以及小腦的含水量;取ICH后24 h和72 h作為檢測時間點,于處死前1 h腹腔注射碘化丙啶(propidium iodide, PI)后取全腦,采用體視學(xué)顯微鏡觀察小鼠大腦出血中心區(qū)及周邊區(qū)PI陽性細胞數(shù),研究不同的自噬激活水平對

4、ICH引起的神經(jīng)細胞死亡的影響。為了進一步探索不同自噬水平對ICH后腦損傷的作用機制,本研究中同樣取ICH后24 h和72 h作為檢測時間點處死小鼠取全腦,運用免疫印跡法分別檢測ICH后24 h和72 h的自噬活性相關(guān)蛋白(Beclin-1,LC3-II,p62)和凋亡相關(guān)蛋白(Bcl-2,Bax,cleaved caspase-3)的表達水平。
　　結(jié)果：⑴3-MA預(yù)處理后,Beclin-1及LC3-II的蛋白表達水平均明顯降低

5、, p62蛋白水平增加;3-MA預(yù)處理組腦出血后的細胞死亡(PI陽性細胞數(shù))顯著減少,腦水腫減輕,運動功能的損害也得到明顯恢復(fù)。相反,雷帕霉素預(yù)處理上調(diào)了Beclin-1和LC3-II的表達,降低了p62的蛋白水平,但增加了腦出血后的細胞死亡數(shù)量、加重了腦水腫及運動功能損害程度。⑵3-MA預(yù)處理顯著降低了ICH引起的Bax和cleaved caspase-3的蛋白表達的上調(diào),但逆轉(zhuǎn)了ICH后Bcl-2的下調(diào);相反,雷帕霉素預(yù)處理后,Ba