膜聯(lián)蛋白A7在腦出血后繼發(fā)性腦損傷中作用的實驗研究.pdf

1、目的:腦出血(intracerebral hemorrhage ICH)是指腦組織中病變的血管突然破裂，血液流進(jìn)周圍的腦組織。ICH占所有中風(fēng)的10％-15％且擁有極高的致殘率和致死率。越來越多的研究證實ICH后繼發(fā)性腦損傷(secondary brain injury SBI)與患者神經(jīng)功能的恢復(fù)密切相關(guān)。興奮性氨基酸毒性在SBI的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著非常重要的病理作用。膜聯(lián)蛋白A7(annexin A7，ANXA7)是一種能促進(jìn)膜

2、融合的鈣依賴性磷脂結(jié)合蛋白，近來研究表明其在多種腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展、轉(zhuǎn)歸中起了非常重要作用。但有關(guān)ANXA7在ICH后SBI中的研究尚未涉及。本實驗通過觀察ANXA7在ICH后SBI中的時相變化，探討ICH后ANXA7的異常表達(dá)是否與神經(jīng)元的興奮性損傷有關(guān)，并進(jìn)一步使用ANXA7的拮抗劑干預(yù)探討其是否對繼發(fā)性腦損傷有保護(hù)作用。
　　方法:實驗1，42只健康成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠隨機分為7組:假手術(shù)組(sha

3、m)，ICH6h，12h，24h，48h，72h，1w組(n=6)，使用基底節(jié)區(qū)注射膠原酶法建立活體ICH模型，分別在以上各時間點處死大鼠灌注并取腦，取基底節(jié)區(qū)血腫周圍的腦組織作為標(biāo)本。應(yīng)用免疫熒光(immunofluorescence IF)共染;半定量PCR(Semi-quantitative RT PCR)和蛋白質(zhì)印跡(Western bolt WB)來檢測血腫周圍腦組織中的ANXA7的表達(dá)，干濕法檢測腦水腫;以滲出伊文思藍(lán)(Ev

4、ans blue EB)的量來評價血腦屏障通透性的改變，進(jìn)而分析ANXA7的表達(dá)與1CH后繼發(fā)性腦損傷是否具有相關(guān)性。實驗2，在實驗1的基礎(chǔ)上，給予外源人重組ANXA7(rh ANXA7)和ANXA7的中和抗體處理，以增強和削弱ANXA7的作用，分析ANXA7在ICH后繼發(fā)性腦損傷發(fā)揮怎樣的作用。將48只健康成年雄性SD大鼠隨機分為sham組(n=12)，ICH組(n=12)，ICH+ rh ANXA7組(n=12)和ICH+ANXA7

5、抗體組(n=12)。在ICH后12h腦室注射rh ANXA7和ANXA7抗體，48小時后處死大鼠。干濕法測定腦水腫，以滲出EB的量來評價血腦屏障(Blood brain barrier BBB)通透性改變，采用末端標(biāo)記法（Terminal-deoxynucleoitidyl Transferase Mediated Nick End LabelingTUNEL)染色與FLUORO-JADE B熒光染色檢測神經(jīng)元細(xì)胞凋亡及壞死比率，高效液

6、相色譜分析法(High performance liquid chromatography HPLC)測定氨基酸含量。實驗3，在實驗1和2的基礎(chǔ)上，分別利用高效液相色譜分析法(High performanceliquid chromatography HPLC)測定腦脊液中谷氨酸含量和免疫沉淀法(Immunoprecipitation IP)檢測ANXA7與SNAP23/SNAP25的相互作用，分析ICH后以及rh ANXA7和ANXA

7、7抗體處理對谷氨酸引起的神經(jīng)興奮性毒性和ANXA7與SNAP23/SNAP25的相互作用的影響，進(jìn)而得出ANXA7在ICH后繼發(fā)性腦損傷中的可能作用機制。
　　結(jié)果:實驗1，與sham組相比，ANXA7的mRNA水平在ICH建立后早期(6h)即有顯著表達(dá)，并在24小時到達(dá)高峰，48小時開始下降，但1w后仍有持續(xù)的高表達(dá);ANXA7的蛋白水平在ICH12h即有顯著的表達(dá)，24小時達(dá)到高峰，1w后的表達(dá)仍高于正常sham組;同時，IC

8、H后腦組織水含量明顯增加，48h時水腫百分?jǐn)?shù)達(dá)到82.4±0.83％; ICH6小時后血腦屏障的通透性開始增加，48小時達(dá)到高峰，局部EB含量達(dá)到3.8 ug/g，1w后基本回到基線水平。綜上說明，伴隨著ICH后繼發(fā)性腦損傷的發(fā)生，ANXA7的表達(dá)水平上升，表明ANXA7與ICH后繼發(fā)性腦損傷可能具有相關(guān)性。實驗2，與ICH組比較，應(yīng)用重組ANXA7蛋白干預(yù)后，凋亡和壞死的比率較單一的ICH組上升顯著，而應(yīng)用ANXA7抗體干預(yù)時，神經(jīng)元

9、凋亡和壞死的比率較ICH組顯著下降。腦水腫含量和血管通透性在應(yīng)用ANXA7蛋白后顯著加重，而應(yīng)用ANXA7抗體干預(yù)時，腦水腫含量和血管通透性顯著改善。綜上說明，ANXA7可能參與并促進(jìn)了ICH后繼發(fā)性腦損傷的發(fā)生發(fā)展。實驗3，HPLC結(jié)果顯示ICH后腦脊液中的谷氨酸含量增高，應(yīng)用ANXA7蛋白干預(yù)時，谷氨酸含量進(jìn)一步上升，而應(yīng)用ANXA7抗體干預(yù)時，則腦脊液中的谷氨酸含量較ICH組顯著下降。此外，IP結(jié)果顯示，sham組中ANXA7與S

10、NAP23/SNAP25相互作用水平較低，而ICH組中結(jié)合活性較sham組顯著上升，rhANXA7進(jìn)一步促進(jìn)ANXA7與SNAP23/SNAP25的相互作用，而應(yīng)用ANXA7抗體干預(yù)時，則可以顯著抑制ICH引起的ANXA7與SNAP23/SNAP25的相互作用。
　　結(jié)論:ICH后，伴隨著繼發(fā)性腦損傷的發(fā)生，ANXA7表達(dá)上升，且ANXA7與SNAP23/SNAP25相互作用增多;rhANXA7可以促進(jìn)ANXA7與SNAP23/S