miR-519d靶向eIF4H對肺腺癌細胞生長侵襲的抑制作用.pdf

1、背景和目的：
　　本課題主要研究肺腺癌組織和細胞中miR-519d和eIF4H的表達情況，分析miR-519d和eIF4H異常表達對肺腺癌的生物學行為的影響，探索miR-519d發(fā)揮作用的可能性機制。本課題分六個章節(jié)進行闡述。
　　第一章 肺腺癌組織中miR-519d和eIF4H的表達分析
　　方法：
　　1.收集標本，69例肺腺癌組織與配對的癌旁正常組織標本均來自于鄭州大學第一附屬醫(yī)院，符合倫理委員會審查標準。

2、
　　2.運用實時qRT-PCR的方法檢測69例肺腺癌組織與配對的癌旁正常組織標本中miR-519d和eIF4H的表達情況。
　　3.統(tǒng)計學分析，運用Pearson相關分析miR-519d和eIF4H之間的相關性以及二者的表達與肺腺癌患者年齡，性別，臨床病理類型，腫瘤TNM分期及有無淋巴結轉移之間的相關性。
　　結果：
　　1.與69例患者癌旁正常組織相比，與之對應的肺腺癌組織中miR-519d的表達呈現(xiàn)顯著下調

3、(P＜0.05)，eIF4H的表達呈現(xiàn)顯著上調(P＜0.05)。
　　2.肺腺癌組織中，miR-519d和eIF4H的表達水平存在負相關關系，R2=0.563，r=-0.75，且具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　3.miR-519d與eIF4H的表達與肺腺癌患者的性別，年齡，疾病分化程度，TNM分期無關(P＞0.05)，與肺腺癌患者淋巴結轉移情況有關(P＜0.05)。
　　第二章 上調miR-519d的表達對肺癌細

4、胞增殖的影響
　　方法：
　　1.培養(yǎng)A549和H1299肺癌細胞。
　　2.通過細胞轉染miR-519d agomir(miR-519d激動劑)獲得miR-519d表達上調的A549和H1299肺腺癌細胞作為miR-519d agomir實驗組;將miR-519dscramble轉染的細胞作為miR-519d scramble陰性對照組;將未轉染細胞作為空白對照組。
　　3.運用實時qRT-PCR技術檢測miR

5、-519d表達上調的肺腺癌細胞實驗組，miR-519d scramble陰性對照組和空白對照組細胞中miR-519d和eIF4H的表達情況。
　　4.運用CCK-8實驗和克隆形成實驗檢測各組中表達上調的miR-519d對細胞增殖能力的影響。
　　5.統(tǒng)計學分析，應用統(tǒng)計學軟件SPSS21.0分析各實驗數據，兩樣本定量資料應用“t檢驗”，配對樣本資料應用“配對樣本t檢驗”，多樣本定量資料應用“單因素方差分析”，檢驗水準α=0.

6、05。
　　結果：
　　1.A549和H1299肺癌細胞系細胞轉染miR-519d agomir后，miR-519d agomir組細胞中miR-519d的表達呈現(xiàn)明顯的上調(P＜0.05)。
　　2.CCK-8實驗結果顯示，與miR-519d scramble陰性對照組和空白對照組相比， miR-519d agomir組細胞增殖數目明顯降低，統(tǒng)計學具有差異(P＜0.05)。
　　3.肺癌細胞克隆形成實驗結果顯示

7、，與miR-519d scramble陰性對照組和空白對照組相比，miR-519d agomir組細胞克隆形成數目顯著降低，統(tǒng)計學具有差異(P＜0.05)。
　　第三章 miR-519d表達上調對肺癌細胞侵襲能力的影響
　　方法：
　　1.將第二章中經轉染處理的細胞，各細胞系均分為以下三組，miR-519d agomir實驗組，miR-519d scramble陰性對照組，空白對照組
　　2.運用細胞侵襲Tran

8、swell實驗比較各組穿膜細胞數，研究體外上調miR-519d的表達對各組細胞侵襲能力的影響。
　　3.統(tǒng)計學分析，應用統(tǒng)計學軟件SPSS21.0分析各實驗數據，多樣本定量資料應用“單因素方差分析”，檢驗水準α=0.05。
　　結果：
　　1.Transwell結果顯示，與miR-519d scramble陰性對照組和空白對照組相比，miR-519d agomir組穿膜細胞的數目顯著降低，統(tǒng)計學具有差異(P＜0.05)

9、。
　　第四章 上調miR-519d的表達對肺癌細胞裸鼠移植瘤生長的影響
　　方法：
　　1.購買并飼養(yǎng)30只BALB/C雌性裸鼠
　　2.根據皮下注射的A549和H1299細胞轉染條件的不同，將裸鼠分為6組進行實驗，每組5只，分別為轉染miR-519d agomir的A549細胞實驗組，轉染miR-519d scramble的A549細胞陰性對照組和未轉染的空白對照組;轉染miR-519d agomir的H12

10、99細胞實驗組，轉染miR-519d scramble的H1299細胞陰性對照組和未轉染的空白對照組。
　　3.應用熒光定量PCR檢測各細胞轉染組miR-519d的表達水平
　　4.應用小動物活體成像技術，每隔一周進行觀察，根據熒光強度判斷裸鼠體內的瘤體生長情況
　　5.裸鼠培養(yǎng)至第四周，解剖取出皮下移植瘤，經石蠟包埋切片后，進行Ki67染色，通過鏡下觀察腫瘤細胞的增殖情況。
　　6.統(tǒng)計學分析，應用統(tǒng)計學軟件S

11、PSS21.0分析各實驗數據，兩樣本定量資料應用“t檢驗”，多樣本定量資料應用“單因素方差分析”，檢驗水準α=0.05。
　　結果：
　　1.在A549和H1299肺癌細胞中，miR-519dagomir轉染組miR-519d的表達均明顯上調，與miR-519d scramble和空白對照組相比具有顯著差異(P＜0.05)。
　　2.小動物活體成像結果顯示，在miR-519d表達上調的情況下，A549和H1299細胞轉

12、染成瘤后表現(xiàn)出的熒光信號明顯弱于miR-519d scramble組和空白對照組，這種強弱之間的差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　3.裸鼠移植瘤石蠟切片Ki67實驗結果顯示在miR-519d表達上調的情況下，移植瘤細胞中Ki67陽性細胞明顯低于miR-519d scramble組和空白對照組，這種數目多少之間的差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　第五章 miR-519d在肺腺癌中發(fā)揮生物學作用機制的初步探索

13、r>　　方法：
　　1.應用生物信息學軟件預測miR-519d和eIF4H的3'UTR區(qū)是否存在互補結合部位。
　　2.構建野生型和突變型eIF4H3'UTR的重組雙熒光素酶報告載體。
　　3.運用雙熒光素酶報告實驗驗證miR-519d是否可靶向作用于eIF4H。
　　結果：
　　1.miR-519d與eIF4H mRNA的3'UTR區(qū)存在互補結合。
　　2成功構建了野生型Wt-pmirGLO-eIF

14、4H和突變型Mt-pmirGLO-eIF4H雙熒光素酶報告載體
　　3.Western Blot實驗結果顯示，miR-519d agomir轉染組中，在miR-519d表達水平上調的情況下，eIF4H蛋白的表達呈明顯下調(P＜0.05)。
　　4.雙熒光素酶報告實驗證實肺腺癌細胞中miR-519d可靶向調控eIF4H的表達。
　　第六章 上調miR-519d與下調eIF4H對肺腺癌細胞生物學作用效果的比較
　　方

15、法：
　　1.合成si-eIF4H，沉默細胞中eIF4H的表達。
　　2.通過細胞轉染miR-519dagomir(miR-519d激動劑)獲得miR-519d表達上調的肺腺癌細胞A549和H1299;通過細胞轉染si-eIF4H獲得eIF4H表達下調的肺腺癌細胞A549和H1299。根據細胞處理方式的不同，將各肺癌細胞分別分為4組，miR-519d agomir組，si-eIF4H組，miR-519d scramble，空

16、白對照組。
　　3.通過Western Blot實驗檢測各組細胞中eIF4H蛋白的表達情況
　　結果：
　　1.與miR-519d scramble組和空白對照組相比，miR-519dagomir組和si-eIF4H組細胞中eIF4H蛋白的表達水平均明顯下降，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，且經統(tǒng)計學分析二者的表達情況無明顯差異(P＞0.05)。
　　2.CCK-8實驗、克隆形成實驗結果表明，與miR-519

17、d scramble組和空白對照組相比，miR-519d agomir轉染組和si-eIF4H細胞轉染組中細胞增殖明顯受到抑制，且二者受抑制的程度無明顯差異（P＞0.05）。
　　3.Transwell實驗結果表明，與miR-519d scramble組和空白對照組相比，miR-519d agomir轉染組和si-eIF4H細胞轉染組中細胞侵襲明顯受到抑制，且二者受抑制的程度無明顯差異(P＞0.05)。
　　結論：