次聲對骨髓間充質干細胞生長情況的影響.pdf

1、研究背景：
　　 干細胞的研究和應用是重大疾病再生性修復和治療的新途徑和新希望。目前關于干細胞的分離、鑒定、培養(yǎng)、擴增、保存、復蘇等關鍵技術得到了各個研究機構及個人的高度關注，而BMSCs因其來源充足、可實現(xiàn)自體移植等優(yōu)點倍受青睞。
　　 次聲波是頻率在0.0001～20Hz范圍內的機械振動波，可能有機械效應、溫熱效應，及化學效應等生物學效應，次聲對人體各系統(tǒng)均有影響，可引起體內細胞的生物學變化，還可對多種體外培養(yǎng)的細胞

2、產生影響。次聲在腦缺血再灌注損傷等神經系統(tǒng)疾病的防護上，有一定效應，還可影響神經前體細胞的增殖。而BMSCs也已經廣泛用于神經系統(tǒng)疾病，其機制可能是通過在體內的神經分化實現(xiàn)的，所以開展次聲對BMSCs的生物學效應研究就是一項非常有必要的課題。
　　 目前，國內學者多研究次聲對成骨細胞、神經前體細胞、小角質細胞、角膜細胞、癌細胞等細胞的超微結構及增殖能力等方面的影響。對BMSCs的研究還鮮有報道，但是已有人做過低強度超聲對BMSC

3、s所產生的生物學效應的研究，發(fā)現(xiàn)低強度超聲可以促進BMSCs的增殖及軟骨定向分化，次聲同樣作為一種機械波，在這方面可能會有共通之處。國外方面:近年來，國外學者對次聲在生物醫(yī)學界的研究較少，多為次聲對機體產生的損傷效應。在細胞培養(yǎng)方面，大多數(shù)人認為某些細胞因子及氨基酸對細胞的培養(yǎng)及分化有一定的作用，但也有人已經提出力學因素在這一方面的作用。
　　 次聲波的生物學效應主要由頻率、時間、強度等參數(shù)來決定，本課題主要觀察低壓級次聲不同作

4、用時間對BMSCs所產生的生物學效應。
　　 研究目的：
　　 觀察次聲對骨髓間充質干細胞(Bone Marrow Stromal Stem Cells，BMSCs)的生物學效應，包括增殖、凋亡和周期分布，以及超微結構的影響，探討次聲合理應用的時間參數(shù)。
　　 材料與方法:
　　 1、細胞的培養(yǎng)和鑒定:用頸椎脫位法處死SD大鼠，分離獲得股骨和脛骨，用DMEM/F12培養(yǎng)基反復沖洗骨髓腔，將沖洗后的骨髓懸液

5、室溫狀態(tài)下離心1000r.p.m,5min。離心結束后，倒掉上清液，用含10％胎牛血清和90％DMEM/F12培養(yǎng)基的細胞全培液重懸細胞，在37°C、5％CO2孵箱中培養(yǎng)，2天后換液，之后每隔2天換液1次。在原代細胞充分融合后，用含0.02％EDTA的25％的胰酶和PBS液(1:1)消化細胞后，傳代純化細胞，所有實驗都采用p3代細胞，采用流式細胞術檢測間充質干細胞的表面抗原標志CD29，CD90和CD45的表達情況，用臺盼藍檢測細胞活力

6、。
　　 2、試驗方法:取P3代細胞分為:實驗組（次聲處理10min，30min，60min）和對照組（空氣暴露相同時間），細胞處理結束后，迅速轉入37°C、5％CO2孵箱中培養(yǎng)。采用CCK8法檢測細胞的增殖活性，流式細胞術進行細胞凋亡和細胞周期分析，以及采用掃描電鏡和透射電鏡觀察細胞的超微結構變化。
　　 增殖實驗在96孔板進行，每組1板共6板。實驗組和對照組細胞數(shù)均調整為4000個/100ul/孔，每組12孔。細胞鋪

7、板后放于孵箱中培養(yǎng)3個小時基本貼壁后，對細胞進行次聲和空氣暴露的處理，之后在每天的相同時間段處理細胞1次，連續(xù)處理3天，處理結束后，迅速將細胞轉入孵箱中培養(yǎng)。細胞鋪板后48小時進行CCK8檢測，每天一次，共觀察3天，每天每培養(yǎng)板取4個復孔。
　　 凋亡實驗和周期分析實驗時，將細胞用培養(yǎng)基重懸后，移至5ml凍存管中進行次聲和對照組的處理，處理結束后將細胞吹打重懸、轉入25cm2培養(yǎng)瓶中，用含10％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基在

8、孵箱中培養(yǎng)3天。
　　 電鏡超微結構觀察實驗時，將細胞用培養(yǎng)基重懸后，移至5ml凍存管中進行次聲和對照組的處理，處理時間為60min。用于掃描電鏡觀察的細胞在處理完后，用全培液重懸并且轉入放有消毒蓋玻片的培養(yǎng)皿中，迅速移入孵箱中培養(yǎng)，過夜。用于透射電鏡觀察的細胞在處理完后，轉入25cm2培養(yǎng)瓶中，用含10％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基在孵箱中培養(yǎng)4天。
　　 各組數(shù)據(jù)以（X±S）表示，采用Spss13.0軟件處理。對

9、OD值的處理用析因設計資料的方差分析，對凋亡率和細胞周期分布率用t檢驗分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　 結果：
　　 1、臺盼藍結果顯示，細胞活力在95％以上，可以進行下一步實驗。
　　 2、表面標志物檢測顯示:CD29和CD90陽性，CD45陰性。
　　 3、采用CCK8法檢測的結果:采用析因設計的方差分析顯示，經次聲處理10min、30min和60min的BMSCs，培養(yǎng)48h后，OD值分

10、別為(0.929±0.042;1.094±0.013;1.410±0.016)，培養(yǎng)72h后，OD值分別為（1.480±0.001;1.348±0.027;1.493±0.017），培養(yǎng)96h后，OD值分別為(1.774±0.127;1.731±0.062;1.833±0.054)，對照組三個培養(yǎng)時間的OD值分別為（1.148±0.088;1.147±0.030;1.112±0.051），(1.479±0.051;1.267±0.006

11、;1.227±0.126)和(1.567±0.032;1.563±0.043;1.632±0.071)，可見培養(yǎng)72h后次聲組細胞OD值均大于對照組，且隨著處理時間的延長，細胞OD值呈現(xiàn)遞增或先減后增的趨勢，在各觀察點次聲處理60min的BMSCsOD值都最高。采用t檢驗進行單獨效應分析，可見兩組間差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 4、細胞凋亡結果顯示:次聲處理10min和60min時，BMSCs的早期凋亡率分別為（1.

12、07％±0.12％和0.97％±0.21％），相應對照組的早期凋亡率分別為（1.43％±0.06％和3.33％±0.15％），可見次聲處理10min和60min后細胞早期凋亡率降低(P＜0.01)，處理60min還可降低BMSCs的中晚期凋亡率、提高正常細胞百分率(P＜0.01)，處理30min時，對BMSCs的細胞凋亡沒有影響。
　　 5、細胞周期結果顯示:次聲處理10min和30min相比，可對BMSCs的細胞周期產生相反的

13、影響，次聲處理10min時，靜止期細胞多于對照組(P＜0.05)，處理30min時靜止期細胞少于對照組(P＜0.01)，而次聲處理60min對BMSCs的細胞周期無影響(P＞0.05)。
　　 6、掃描電鏡下顯示:次聲處理60min培養(yǎng)1天的細胞在細胞大小、形狀、表面微絨毛程度與空氣暴露對照組有較大差異，次聲組細胞多舒展開，為長條狀，細胞較長，表面微絨毛較多;對照組含有大量圓形透亮細胞，表面微絨毛較少，提示細胞死亡或活力低下。<

14、br>　　 7、透射電鏡下顯示:次聲處理60min培養(yǎng)4天的細胞與對照組細胞相比，細胞狀態(tài)良好，細胞器大量存在，細胞核沒有明顯改變，核膜清晰;對照組有大量細胞出現(xiàn)核破裂、核溶解，可見大量溶酶體出現(xiàn)，提示細胞大量死亡。
　　 結論：
　　 1.次聲可以促進BMSCs的增殖，沒有發(fā)現(xiàn)次聲引起B(yǎng)MSCs的凋亡，次聲處理細胞60min后可抑制細胞凋亡;次聲作用3天后大多數(shù)BMSCs停留在靜止期，但次聲可以干擾BMSCs的周期分