次聲對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生長情況的影響.pdf

1、研究背景：
　　 干細(xì)胞的研究和應(yīng)用是重大疾病再生性修復(fù)和治療的新途徑和新希望。目前關(guān)于干細(xì)胞的分離、鑒定、培養(yǎng)、擴(kuò)增、保存、復(fù)蘇等關(guān)鍵技術(shù)得到了各個研究機(jī)構(gòu)及個人的高度關(guān)注，而BMSCs因其來源充足、可實(shí)現(xiàn)自體移植等優(yōu)點(diǎn)倍受青睞。
　　 次聲波是頻率在0.0001～20Hz范圍內(nèi)的機(jī)械振動波，可能有機(jī)械效應(yīng)、溫?zé)嵝?yīng)，及化學(xué)效應(yīng)等生物學(xué)效應(yīng)，次聲對人體各系統(tǒng)均有影響，可引起體內(nèi)細(xì)胞的生物學(xué)變化，還可對多種體外培養(yǎng)的細(xì)胞

2、產(chǎn)生影響。次聲在腦缺血再灌注損傷等神經(jīng)系統(tǒng)疾病的防護(hù)上，有一定效應(yīng)，還可影響神經(jīng)前體細(xì)胞的增殖。而BMSCs也已經(jīng)廣泛用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病，其機(jī)制可能是通過在體內(nèi)的神經(jīng)分化實(shí)現(xiàn)的，所以開展次聲對BMSCs的生物學(xué)效應(yīng)研究就是一項非常有必要的課題。
　　 目前，國內(nèi)學(xué)者多研究次聲對成骨細(xì)胞、神經(jīng)前體細(xì)胞、小角質(zhì)細(xì)胞、角膜細(xì)胞、癌細(xì)胞等細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)及增殖能力等方面的影響。對BMSCs的研究還鮮有報道，但是已有人做過低強(qiáng)度超聲對BMSC

3、s所產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)的研究，發(fā)現(xiàn)低強(qiáng)度超聲可以促進(jìn)BMSCs的增殖及軟骨定向分化，次聲同樣作為一種機(jī)械波，在這方面可能會有共通之處。國外方面:近年來，國外學(xué)者對次聲在生物醫(yī)學(xué)界的研究較少，多為次聲對機(jī)體產(chǎn)生的損傷效應(yīng)。在細(xì)胞培養(yǎng)方面，大多數(shù)人認(rèn)為某些細(xì)胞因子及氨基酸對細(xì)胞的培養(yǎng)及分化有一定的作用，但也有人已經(jīng)提出力學(xué)因素在這一方面的作用。
　　 次聲波的生物學(xué)效應(yīng)主要由頻率、時間、強(qiáng)度等參數(shù)來決定，本課題主要觀察低壓級次聲不同作

4、用時間對BMSCs所產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)。
　　 研究目的：
　　 觀察次聲對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone Marrow Stromal Stem Cells，BMSCs)的生物學(xué)效應(yīng)，包括增殖、凋亡和周期分布，以及超微結(jié)構(gòu)的影響，探討次聲合理應(yīng)用的時間參數(shù)。
　　 材料與方法:
　　 1、細(xì)胞的培養(yǎng)和鑒定:用頸椎脫位法處死SD大鼠，分離獲得股骨和脛骨，用DMEM/F12培養(yǎng)基反復(fù)沖洗骨髓腔，將沖洗后的骨髓懸液

5、室溫狀態(tài)下離心1000r.p.m,5min。離心結(jié)束后，倒掉上清液，用含10％胎牛血清和90％DMEM/F12培養(yǎng)基的細(xì)胞全培液重懸細(xì)胞，在37°C、5％CO2孵箱中培養(yǎng)，2天后換液，之后每隔2天換液1次。在原代細(xì)胞充分融合后，用含0.02％EDTA的25％的胰酶和PBS液(1:1)消化細(xì)胞后，傳代純化細(xì)胞，所有實(shí)驗(yàn)都采用p3代細(xì)胞，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測間充質(zhì)干細(xì)胞的表面抗原標(biāo)志CD29，CD90和CD45的表達(dá)情況，用臺盼藍(lán)檢測細(xì)胞活力

6、。
　　 2、試驗(yàn)方法:取P3代細(xì)胞分為:實(shí)驗(yàn)組（次聲處理10min，30min，60min）和對照組（空氣暴露相同時間），細(xì)胞處理結(jié)束后，迅速轉(zhuǎn)入37°C、5％CO2孵箱中培養(yǎng)。采用CCK8法檢測細(xì)胞的增殖活性，流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期分析，以及采用掃描電鏡和透射電鏡觀察細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)變化。
　　 增殖實(shí)驗(yàn)在96孔板進(jìn)行，每組1板共6板。實(shí)驗(yàn)組和對照組細(xì)胞數(shù)均調(diào)整為4000個/100ul/孔，每組12孔。細(xì)胞鋪

7、板后放于孵箱中培養(yǎng)3個小時基本貼壁后，對細(xì)胞進(jìn)行次聲和空氣暴露的處理，之后在每天的相同時間段處理細(xì)胞1次，連續(xù)處理3天，處理結(jié)束后，迅速將細(xì)胞轉(zhuǎn)入孵箱中培養(yǎng)。細(xì)胞鋪板后48小時進(jìn)行CCK8檢測，每天一次，共觀察3天，每天每培養(yǎng)板取4個復(fù)孔。
　　 凋亡實(shí)驗(yàn)和周期分析實(shí)驗(yàn)時，將細(xì)胞用培養(yǎng)基重懸后，移至5ml凍存管中進(jìn)行次聲和對照組的處理，處理結(jié)束后將細(xì)胞吹打重懸、轉(zhuǎn)入25cm2培養(yǎng)瓶中，用含10％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基在

8、孵箱中培養(yǎng)3天。
　　 電鏡超微結(jié)構(gòu)觀察實(shí)驗(yàn)時，將細(xì)胞用培養(yǎng)基重懸后，移至5ml凍存管中進(jìn)行次聲和對照組的處理，處理時間為60min。用于掃描電鏡觀察的細(xì)胞在處理完后，用全培液重懸并且轉(zhuǎn)入放有消毒蓋玻片的培養(yǎng)皿中，迅速移入孵箱中培養(yǎng)，過夜。用于透射電鏡觀察的細(xì)胞在處理完后，轉(zhuǎn)入25cm2培養(yǎng)瓶中，用含10％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基在孵箱中培養(yǎng)4天。
　　 各組數(shù)據(jù)以（X±S）表示，采用Spss13.0軟件處理。對

9、OD值的處理用析因設(shè)計資料的方差分析，對凋亡率和細(xì)胞周期分布率用t檢驗(yàn)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1、臺盼藍(lán)結(jié)果顯示，細(xì)胞活力在95％以上，可以進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。
　　 2、表面標(biāo)志物檢測顯示:CD29和CD90陽性，CD45陰性。
　　 3、采用CCK8法檢測的結(jié)果:采用析因設(shè)計的方差分析顯示，經(jīng)次聲處理10min、30min和60min的BMSCs，培養(yǎng)48h后，OD值分

10、別為(0.929±0.042;1.094±0.013;1.410±0.016)，培養(yǎng)72h后，OD值分別為（1.480±0.001;1.348±0.027;1.493±0.017），培養(yǎng)96h后，OD值分別為(1.774±0.127;1.731±0.062;1.833±0.054)，對照組三個培養(yǎng)時間的OD值分別為（1.148±0.088;1.147±0.030;1.112±0.051），(1.479±0.051;1.267±0.006

11、;1.227±0.126)和(1.567±0.032;1.563±0.043;1.632±0.071)，可見培養(yǎng)72h后次聲組細(xì)胞OD值均大于對照組，且隨著處理時間的延長，細(xì)胞OD值呈現(xiàn)遞增或先減后增的趨勢，在各觀察點(diǎn)次聲處理60min的BMSCsOD值都最高。采用t檢驗(yàn)進(jìn)行單獨(dú)效應(yīng)分析，可見兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 4、細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示:次聲處理10min和60min時，BMSCs的早期凋亡率分別為（1.

12、07％±0.12％和0.97％±0.21％），相應(yīng)對照組的早期凋亡率分別為（1.43％±0.06％和3.33％±0.15％），可見次聲處理10min和60min后細(xì)胞早期凋亡率降低(P＜0.01)，處理60min還可降低BMSCs的中晚期凋亡率、提高正常細(xì)胞百分率(P＜0.01)，處理30min時，對BMSCs的細(xì)胞凋亡沒有影響。
　　 5、細(xì)胞周期結(jié)果顯示:次聲處理10min和30min相比，可對BMSCs的細(xì)胞周期產(chǎn)生相反的

13、影響，次聲處理10min時，靜止期細(xì)胞多于對照組(P＜0.05)，處理30min時靜止期細(xì)胞少于對照組(P＜0.01)，而次聲處理60min對BMSCs的細(xì)胞周期無影響(P＞0.05)。
　　 6、掃描電鏡下顯示:次聲處理60min培養(yǎng)1天的細(xì)胞在細(xì)胞大小、形狀、表面微絨毛程度與空氣暴露對照組有較大差異，次聲組細(xì)胞多舒展開，為長條狀，細(xì)胞較長，表面微絨毛較多;對照組含有大量圓形透亮細(xì)胞，表面微絨毛較少，提示細(xì)胞死亡或活力低下。<

14、br>　　 7、透射電鏡下顯示:次聲處理60min培養(yǎng)4天的細(xì)胞與對照組細(xì)胞相比，細(xì)胞狀態(tài)良好，細(xì)胞器大量存在，細(xì)胞核沒有明顯改變，核膜清晰;對照組有大量細(xì)胞出現(xiàn)核破裂、核溶解，可見大量溶酶體出現(xiàn)，提示細(xì)胞大量死亡。
　　 結(jié)論：
　　 1.次聲可以促進(jìn)BMSCs的增殖，沒有發(fā)現(xiàn)次聲引起B(yǎng)MSCs的凋亡，次聲處理細(xì)胞60min后可抑制細(xì)胞凋亡;次聲作用3天后大多數(shù)BMSCs停留在靜止期，但次聲可以干擾BMSCs的周期分