過表達血紅素加氧酶-1的骨髓間充質(zhì)干細胞對內(nèi)毒素誘導(dǎo)急性肺損傷大鼠的保護作用及機制研究.pdf

1、目的:
　　應(yīng)用經(jīng)慢病毒轉(zhuǎn)染后過表達血紅素加氧酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)的雄性大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)通過尾靜脈輸注到內(nèi)毒素導(dǎo)致急性肺損傷的雌性大鼠體內(nèi)后，觀察過表達HO-1的BMSCs對內(nèi)毒素誘導(dǎo)急性肺損傷大鼠的保護作用，并利用免疫熒光、免疫組化、原位雜交方法觀察BMSCs在大鼠肺組織內(nèi)定植及分化情況;同時從抑制炎癥反應(yīng)、氧

2、化應(yīng)激、凋亡及調(diào)節(jié)TLR通路幾方面探討其治療急性肺損傷可能的機制。
　　方法:
　　1.BMSC及HO-1-BMSC的培養(yǎng)與鑒定:通過全骨髓貼壁法，分離和培養(yǎng)來源于雄性大鼠的股骨及脛骨骨髓組織中的BMSCs，通過流式細胞術(shù)行細胞免疫表型鑒定并行多胚層分化實驗進一步鑒定BMSCs。之后通過慢病毒載體將目的基因HO-1轉(zhuǎn)染至第3代BMSCs，并應(yīng)用western blot、qRT-PCR檢測HO-1在BMSCs中表達的情況。

3、r>　　2.內(nèi)毒素致大鼠急性肺損傷模型建立及HO-1-BMSC對急性肺損傷大鼠的保護作用:將雌性Wistar大鼠分為生理鹽水治療組(NS group)，BMSCs治療組(BMSCs group)，攜帶HO-1基因的Lenti-virus治療組(HO-1-Lenti-virus group)和過表達HO-1的BMSCs治療組(HO-1-BMSCs group)，各組大鼠均以6L/min的流速經(jīng)霧化吸入含3mg/ml脂多糖(LPS)的霧化懸

4、液20分鐘，連續(xù)霧化七天。首次霧化1h之后各組分別給予鼠尾靜脈注射生理鹽水、BMSCs、攜帶HO-1基因的慢病毒顆粒及HO-1-BMSCs。在霧化吸入LPS后的1d、3d、7d，分別留取各個組大鼠的肺組織標本及肺泡灌洗液(BALF)，進行肺組織濕干比計算，BALF中中性粒細胞計數(shù)，肺組織HE染色及肺組織損傷評分，評價HO-1-BMSCs對ALI的保護效應(yīng)
　　3.HO-1-BMSC在大鼠肺組織內(nèi)定植、分化檢測:應(yīng)用western

5、blot檢測各組肺組織內(nèi)HO-1的表達情況，PCR檢測肺組織HO-1基因表達情況，免疫組化檢測GFP蛋白表達情況，免疫熒光檢測HO-1-BMSCs組HO-1、和肺上皮特異性蛋白pan cytokeratin(pan CK)的表達情況，聯(lián)合應(yīng)用Y染色體特異性基因SRY原位雜交示蹤技術(shù)進行共定位，觀察HO-1-BMSCs在肺組織損傷時的歸巢、分化情況。
　　4.HO-1-BMSC急性肺損傷保護效應(yīng)的機制探討:各干預(yù)組肺組織行TUNEL

6、染色，并用western blot檢測Caspase-3表達水平。ELISA檢測肺組織和血清中TNF-α、IL-1β、IL-10、SOD、MPO、MDA的表達，western blot法檢測TLR信號通路中接頭分子TLR4、MyD88、TRAF6的表達情況，western blot法檢測肺組織中NF-κB水平，提取核蛋白檢測磷酸化NF-κB水平，以此判斷TLR通路及NF-κB活化程度。從炎癥、氧化應(yīng)激、細胞凋亡及TLR通路活化程度幾方面

7、進一步探討過表達HO-1基因的BMSCs改善急性肺損傷可能的機制。
　　結(jié)果:
　　1.BMSC及HO-1-BMSC的培養(yǎng)與鑒定:自骨髓分離培養(yǎng)的BMSCs經(jīng)流式細胞鑒定細胞免疫表型及多胚層分化實驗證實其符合MSCs特性。并且通過慢病毒轉(zhuǎn)染后HO-1基因后其細胞免疫表型及多胚層分化能力未發(fā)生改變。同時應(yīng)用westerbolt法及qRT-PCR法檢測HO-1-BMSCs中HO-1表達情況，證實轉(zhuǎn)染后的BMSCs可穩(wěn)定表達HO-

8、1基因。
　　2.HO-1-BMSC對急性肺損傷大鼠的保護作用:在內(nèi)毒素致大鼠急性肺損傷并進行各組干預(yù)后進行肺組織濕干比計算、BALF中中性粒細胞計數(shù)、肺組織HE染色及肺損傷評分發(fā)現(xiàn)給以輸注BMSCs的治療組、攜帶HO-1基因的Lenti-virus治療組、HO-1-BMSCs組的大鼠濕重比低于生理鹽水組(P＜0.01），BALF中性粒細胞計數(shù)低于生理鹽水組(P＜0.01)，肺損傷程度及評分較生理鹽水組的大鼠低(P＜0.05，提示

9、這三組均不同程度改善了肺損傷程度，其中以HO-1-BMSCs組大鼠的肺損傷改善程度最為明顯;
　　3.HO-1-BMSC在大鼠肺組織內(nèi)定植、分化檢測:經(jīng)westernblot檢測各組肺組織發(fā)現(xiàn)與其他各干預(yù)組相比較，HO-1-BMSCs組中的大鼠肺組織內(nèi)HO-1蛋白表達水平明顯增加(P＜0.01);PCR檢測結(jié)果也提示HO-1-BMSCs組大鼠中HO-1mRNA表達水平也明顯高于其他三組(P＜0.01);其中HO-1-BMSCs組可

10、在大鼠肺組織中檢測到來源于雌性大鼠的SRY基因表達，且表達明顯高于BMSCs組(P＜0.01）;并通過免疫組化和免疫熒光法發(fā)現(xiàn)HO-1-BMSCs組肺組織中可檢測到GFP、HO-1和pan CK蛋白的表達，進一步證實HO-1-BMSCs在肺組織內(nèi)的定位與轉(zhuǎn)化。
　　4.HO-1-BMSC急性肺損傷保護機制探討:HO-1-BMSCs組與其他各組比較，輸注過表達HO-1的BMSCs治療3d后大鼠肺實質(zhì)細胞凋亡水平下降，并且Caspas

11、e-3表達水平明顯低于其余三組(P＜0.01)。血清及肺組織勻漿中TNF-α、IL-1β表達明顯下降，IL-10表達較其他干預(yù)組高;氧化應(yīng)激相關(guān)指標中SOD表達增加，MPO、MDA表達水平明顯下降(P＜0.01);而在接受HO-1-BMSCs干預(yù)3d的大鼠肺組織中TLR4、MyD88、TRAF6、IRAK表達水平較其余三組明顯下降(P＜0.01)，NF-κB轉(zhuǎn)錄活性明顯受抑(P＜0.01)。
　　結(jié)論:
　　1、成功分離、培

12、養(yǎng)了大鼠BMSCs，利用重組慢病毒lenti-GV287-EGFP-HO-1轉(zhuǎn)染大鼠BMSCs，構(gòu)建穩(wěn)定表達HO-1的BMSCs(HO-1-BMSCs)。過表達HO-1的BMSCs的細胞免疫表型及多向分化能力未發(fā)生改變，保留了BMSCs的基本特征。2、本研究在國內(nèi)外首次采用性別不匹配的同種異體移植法將過表達HO-1基因的雄性大鼠BMSC治療內(nèi)毒素導(dǎo)致雌性大鼠急性肺損傷模型，過表達HO-1的BMSCs較未轉(zhuǎn)染的BMSCs對內(nèi)毒素誘導(dǎo)急性肺