人淀粉代謝相關α-1,4糖苷酶類與其抑制劑相互作用機制的結構生物學研究.pdf

1、淀粉經過人體代謝消化產生終產物葡萄糖的過程涉及到一系列的α-糖苷酶類，如唾液淀粉酶(HSA)，胰腺淀粉酶(HPA)，麥芽糖苷酶(maltase-glucoamylase，MGAM)，蔗糖糖苷酶(sucrose-isomaltase，SI)等。而α-糖苷酶抑制劑(α-glycosidase inhibitor，AGI)可以抑制最終產物葡萄糖的產生，從而抑制餐后高血糖，對于2型糖尿病有很好的治療效果。通過研究α-糖苷酶抑制劑與靶點α-糖苷酶

2、間的作用機理不僅可以深入了解酶分子的作用方式并且有助于開發(fā)設計更高藥效的α-糖苷酶抑制劑類藥物。
　　 本研究首先從淀粉的α-1，4糖苷鍵內切相關酶類的克隆、表達入手，成功構建人胰腺淀粉酶(HPA)，麥芽糖苷酶N端結構域(MGAM-N)，麥芽糖苷酶C端結構域(MGAM-C)的畢赤酵母表達菌株，分別命名為HPA-GS115，MGAM-N-GS115，MGAM-C-GS115。首次報道了人MGAM-C蛋白的克隆表達，使得同時研究HP

3、A，MGAM-N與MGAM-C的性質成為可能。隨后利用不同的蛋白純化方法，如糖原沉淀、疏水層析、金屬離子親和層析、離子交換層析和分子排阻層析等成功獲得了高純度的HPA、MGAM-N和MGAM-C重組蛋白，其酶活力分別為136.5 U/mg、5.15 U/mg和20.23 U/mg。
　　 分別以HPA、MGAM-N和MGAM-C重組蛋白為材料，在酶學水平研究其在糖代謝途徑中的催化作用。通過不同的α-葡萄糖苷酶抑制劑對HPA、MG

4、AM-N和MGAM-C的抑制情況來分析HPA、MGAM-N和MGAM-C的催化特異性、底物特異性以及對不同α-葡萄糖苷酶抑制劑的耐受性。使我們對α-糖苷酶抑制劑的抑制能力在整體輪廓上有更深刻的認識。
　　 研究結果表明，1-脫氧野尻霉素(1-deoxynojimycin，DNJ)是MGAM最有效的抑制劑，其對兩個催化結構域MGAM-N和MGAM-C的Ki值分別達到了1.41和2.04μM。而阿卡他定類化合物Acarviostat

5、in2-03和3-03(A2-03，A3-03)是HPA的最佳抑制劑，Ki值分別為15和14.3 nM。A2-03，A3-03同時也對MGAM-C顯示出相對較高的抑制活性，其Ki值分別為6.02μM和6.08μM。研究發(fā)現，盡管MGAM-N和MGAM-C結構同源性很高，但它們具有不同的底物特異性以及α-葡萄糖苷酶抑制活性。
　　 以高純度的HPA為材料獲得高分辨率的A1-03，A2-03，A3-03，A4-03與HPA的復合晶體

6、。結構生物學分析表明，A1-03具備與acarbose類似的重排模式。A1-03在HPA活性中心經歷了一系列的水解和縮合反應，最終產生6個糖環(huán)的重排產物占據HPA的活性中心。與此同時，A2-03，A3-03和A4-03只進行水解反應，最終以7個糖環(huán)的終產物占據HPA活性中心。結合結構生物學與酶學動力學分析表明：經水解和重排修飾的7個糖環(huán)的終產物是最適合HPA活性中心的抑制劑結構，顯示了最強的抑制效果。同時高分辨率的晶體結構首次顯示了ac

7、arviostatins中A2-03，A3-03，A4-03抑制劑的重排產物與HPA活性部位的-4位點均發(fā)揮作用，從而能更好的抑制HPA的催化活性，為新型HPA靶標藥物分子設計提供重要靶點信息。
　　 同時，本論文首次解析了MGAM-C以及與acarbose復合晶體結構。結果顯示acarbose分子結合于MGAM-C催化活性中心部位，占據-1到+3位點，acarviosine單元中的N-連接糖苷鍵占據催化中心的-1到+1位中間部

8、位。酶學動力學研究表明：MGAM-N對G2至G6的糖環(huán)底物具有類似的結合常數。但MGAM-C對G3至G6糖環(huán)底物有更強的親和能力，而對于麥芽糖(G2)的親和能力則較低。這表明MGAM-N和MGAM-C活性中心對于不同長度底物存在選擇性。而通過Dpn1介導了活性位點的定點突變獲得了MGAM-N-Y299W，MGAM-C-Y1251W和MGAM-C-deltaS畢赤酵母表達突變菌株。突變體酶活性分析結果顯示：酪氨酸(Y1251W)到色氨酸的

9、突變賦予了MGAM-C酶分子水解α-1，6糖苷鍵能力；MGAM-C結構中存在的21個額外的氨基酸賦予了其對長底物片段更好的偏好性；而敲除此段序列后其底物特異性與MGAM-N非常類似，這在一定程度上解釋了MGAM-N，MGAM-C和SI-N不同的底物特異性的分子機制。
　　 本研究利用畢赤酵母表達系統(tǒng)分別克隆表達并純化了HPA、MGAM-N和MGAM-C重組蛋白，研究其酶學性質以及與不同α-糖苷酶抑制劑的相互作用關系，并獲得aca