利奈唑胺、萬(wàn)古霉素體外誘導(dǎo)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌耐藥株轉(zhuǎn)錄組學(xué)及適應(yīng)性的研究.pdf

1、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin resistant Staphylococcus aureus，MRSA）引起的感染日益增多，而MRSA對(duì)大部分抗生素產(chǎn)生不同程度的耐藥，僅少數(shù)藥物敏感，因此，MRSA引起的感染治療十分棘手。利奈唑胺和萬(wàn)古霉素是臨床治療MRSA感染的一線藥物，一旦對(duì)這兩類(lèi)藥物產(chǎn)生耐藥，MRSA引起感染的治療將面臨窘境。近年來(lái)，臨床耐利奈唑胺的MRSA菌株（LRSA）和耐萬(wàn)古霉素的MRSA菌株（VRSA）

2、時(shí)有報(bào)道。本研究分別體外誘導(dǎo)對(duì)利奈唑胺和萬(wàn)古霉素耐藥的MRSA菌株，利用逆轉(zhuǎn)錄高通量測(cè)序技術(shù)篩選差異表達(dá)基因和突變基因，qRT-PCR驗(yàn)證，并比較菌株的適應(yīng)性代價(jià)和生物性狀的變化。
　　目的：
　　探討耐利奈唑胺和萬(wàn)古霉素的MRSA菌株的耐藥機(jī)制、適應(yīng)性代價(jià)及生物性狀的改變，為延緩耐藥性的產(chǎn)生和臨床制定合理的抗生素用藥策略提供理論支持，并為尋找新的藥物靶點(diǎn)、研發(fā)抗菌藥物提供參考。
　　方法：
　　1.菌株的誘導(dǎo)：

3、從臨床分離MRSA，微量稀釋法測(cè)定其對(duì)抗生素的MIC，多步誘導(dǎo)法分別誘導(dǎo)對(duì)利奈唑胺和萬(wàn)古霉素耐藥。法國(guó)生物-梅里埃公司VITEK-60AMS全自動(dòng)微生物分析儀系統(tǒng)進(jìn)行鑒定和生化反應(yīng)的測(cè)定。
　　2.適應(yīng)性的研究：測(cè)定母菌株和誘導(dǎo)耐藥株的生長(zhǎng)率，競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)比較菌株在體外的生存適應(yīng)性。
　　3.轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和驗(yàn)證：提取母菌株和誘導(dǎo)耐藥株RNA，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，篩選突變基因和差異表達(dá)基因，實(shí)時(shí)定量PCR對(duì)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。

4、>　　4. PCR擴(kuò)增測(cè)序檢測(cè)誘導(dǎo)耐藥菌株的耐藥基因。
　　5.生物性狀分析：TritonX-100誘導(dǎo)測(cè)定菌株的自溶率，紅細(xì)胞溶血實(shí)驗(yàn)鑒別菌株的溶血能力，細(xì)胞毒力試驗(yàn)比較菌株毒性變化。
　　結(jié)果：
　　1.體外誘導(dǎo)MRSA臨床分離株（MRSA2733）對(duì)利奈唑胺耐藥（MRSA2733-L16，MIC=16μg/ml）和萬(wàn)古霉素耐藥（MRSA2733-W16，MIC=16μg/ml）分別約傳代培養(yǎng)了50代和370代；M

5、RSA2733-L16和MRSA2733-W16對(duì)亞胺培南，苯唑西林和紅霉素的敏感性均增加；MRSA2733-L16和MRSA2733-W16的 D-甘露糖試驗(yàn)為陽(yáng)性，MRSA2733-W16對(duì)β-D-半乳糖苷酶和尿素酶試驗(yàn)結(jié)果呈陰性，與MRSA2733的結(jié)果相反。
　　2. MRSA2733-L16和MRSA2733-W16菌株對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)率沒(méi)有差異，但都比母菌株低；與母菌株相比，MRSA2733-L16和MRSA2733-W16

6、菌株體外生存競(jìng)爭(zhēng)能力顯著降低，MRSA2733-W16株下降更加明顯。
　　3.與MRSA2733相比，MRSA2733-L16和MRSA2733-W16分別有329和713個(gè)基因表達(dá)發(fā)生2倍以上差異。差異表達(dá)和突變基因主要包括β-內(nèi)酰胺類(lèi)耐藥基因，核糖體蛋白基因，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白和雙組分系統(tǒng)基因，氨?；?tRNA生物合成酶基因，代謝通路基因及毒力與感染相關(guān)基因。Real-time PCR驗(yàn)證結(jié)果與Solexa RNA-Seq一致

7、。
　　4. MRSA2733-L16菌株23S核糖體蛋白結(jié)構(gòu)域V位點(diǎn)及核糖體蛋白L3、L4位點(diǎn)突變。
　　5. MRSA2733-L16菌株自溶率未發(fā)生明顯變化，而MRSA2733-W16菌株自溶率降低；60 min時(shí)，MRSA2733-L16菌株溶血增加8％，而MRSA2733-W16菌株在30 min、60 min時(shí)溶血分別降低22%和15%，120 min時(shí)，三株菌株的溶血能力未明顯差別；MRSA2733-L16和M

8、RSA2733-W16對(duì)肺上皮細(xì)胞 A549的毒性均降低，MRSA2733-W16對(duì)細(xì)胞的黏附力明顯降低。
　　結(jié)論：
　　1.萬(wàn)古霉素誘導(dǎo)MRSA菌株耐藥困難可能由耐藥菌株的高適應(yīng)性代價(jià)造成。耐利奈唑胺和萬(wàn)古霉素MRSA菌株生化反應(yīng)的變化，可能影響臨床檢測(cè)鑒定。
　　2.23S核糖體蛋白結(jié)構(gòu)域V的G2474T、G2603T、A2289G、C2490A位點(diǎn)突變結(jié)合L3（rplC） L4（rplD）突變可能是MRSA對(duì)利

9、奈唑胺耐藥的主要機(jī)制。雙組份調(diào)節(jié)系統(tǒng)操縱子的表達(dá)誘導(dǎo)pbp2轉(zhuǎn)錄增加和雙組份調(diào)節(jié)系統(tǒng)基因突變介導(dǎo)MRSA細(xì)胞壁增厚是耐萬(wàn)古霉素MRSA產(chǎn)生的主要機(jī)制。
　　3.耐利奈唑胺和萬(wàn)古霉素MRSA菌株對(duì)亞胺培南、苯唑西林的敏感性增加可能與pbp4和ebh基因位點(diǎn)突變相關(guān)。耐利奈唑胺和萬(wàn)古霉素MRSA菌株對(duì)紅霉素敏感性增加可能分別由同源性基因重組和適應(yīng)性下降引起。
　　4.耐利奈唑胺和萬(wàn)古霉素MRSA菌株agrC基因位點(diǎn)的突變和agr