腦膠質(zhì)瘤Wip1基因與DNA核苷酸切除修復(fù)關(guān)系的初步研究.pdf

1、膠質(zhì)瘤屬于神經(jīng)上皮組織腫瘤，約占神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的40％，具有侵襲性強(qiáng)且容易復(fù)發(fā)等特點(diǎn)。目前治療以手術(shù)為主，輔以化療和放療，但預(yù)后不佳。由PPM1D基因編碼的野生型p53誘導(dǎo)的磷酸酶1（Wild type p53-induced phosphatase1,Wip1）是一種原癌基因。Wip1由p53誘導(dǎo)，且能夠通過(guò)負(fù)反饋調(diào)節(jié)p53功能在DNA損傷反應(yīng)中起重要作用。Wip1作為重要的凋亡調(diào)節(jié)因子，除了在腫瘤的發(fā)生中起到重要作用，還參與細(xì)胞應(yīng)激以

2、及DNA損傷修復(fù)的調(diào)節(jié)。此調(diào)節(jié)過(guò)程包括DNA核苷酸切除修復(fù)過(guò)程。核苷酸切除修復(fù)(nucleotide excision repair，NER)是DNA損傷修復(fù)的主要途徑，包括 ERCC1—6、XPC、XPA等因子參與其中。XPA是損傷部位的識(shí)別蛋白，在NER途徑中處于核心地位。XPC在NER過(guò)程中起重要作用，可能是激活NER的早期損傷識(shí)別因子。XPA和XPC均位于細(xì)胞核內(nèi)，參與到NER過(guò)程中。小鼠研究指出，當(dāng)接受一定強(qiáng)度的紫外線照射時(shí)，

3、Wip1可與XPA、XPC發(fā)生磷酸化關(guān)系導(dǎo)致其失活，進(jìn)而阻止NER的發(fā)生。本研究分為兩個(gè)部分：
　　第一部分：U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞Wip1基因沉默模型的建立以及協(xié)同 TMZ化療對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞活性影響的研究。
　　目的：
　　構(gòu)建U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞系Wip1基因沉默模型，研究Wip1基因沉默協(xié)同替莫唑胺化療對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖情況的影響。
　　方法：
　　體外培養(yǎng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞 U251，采用攜帶 Wip1基因 RNA干

4、擾載體的慢病毒沉默Wip1基因，并經(jīng)實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證。采用陰性對(duì)照病毒感染處理對(duì)照組。然后使用替莫唑胺進(jìn)行化療干預(yù)，將研究分組設(shè)定為NC組、NC+TMZ組、Wip1組和Wip1+TMZ組。最后通過(guò)CCK-8法檢測(cè)各組細(xì)胞的增殖情況。
　　結(jié)果：
　?、怕《据d體包裝穩(wěn)定保存，且含便于熒光顯微鏡下觀察的GTP。本研究以GTP表達(dá)率初步判定慢病毒感染效率。每天觀察1次。在感染后第3-4天，GTP表達(dá)情況可達(dá)90%以上（圖1-1

5、）。空白對(duì)照組、NC組、Wip1組Wip1 mRNA表達(dá)情況分析結(jié)果分別為1.00±0.00、1.08±0.10、0.30±0.08（表1-1和圖1-2）。Wip1組Wip1基因表達(dá)明顯低于其余兩組（P<0.05），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。qPCR驗(yàn)證提示經(jīng)過(guò)本課題組慢病毒感染U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞，Wip1基因被有效沉默。⑵通過(guò)CCK8法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，結(jié)果詳見(jiàn)圖1-3和表1-2。各組細(xì)胞增殖速率由低到高依次為Wip1+TMZ組、Wip1組

6、、NC+TMZ組、NC組。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，以上4組差異逐漸增大，第48h（P＜0.05）、72h（P＜0.05）、96h（P＜0.05）、120h（P＜0.05）、144h（P＜0.05）各個(gè)時(shí)間點(diǎn)組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。化療干預(yù)后第48h、72h、96h、120h以及144h五個(gè)時(shí)間點(diǎn)，Wip1+TMZ組細(xì)胞增殖率低于其他各組（P＜0.05）。在作用48 h后，任兩組同一時(shí)間測(cè)得的OD值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中

7、，本研究以48 h作為U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞分子檢測(cè)的時(shí)間點(diǎn)。
　　結(jié)論：
　　①本課題組穩(wěn)定保存的慢病毒載體能夠成功構(gòu)建U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞Wip1基因沉默模型。②證實(shí)無(wú)論是單純的沉默 Wip1基因或替莫唑胺化療都會(huì)抑制U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。當(dāng)兩者同時(shí)干預(yù)，U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)接近停止。
　　第二部分：U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞Wip1基因沉默以及協(xié)同TMZ化療對(duì)DNA核苷酸切除修復(fù)酶XPA、XPC的影響。
　　目的：<

8、br>　　通過(guò)靶向Wip1基因沉默協(xié)同化療，探討U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞Wip1基因沉默以及協(xié)同TMZ化療對(duì)DNA核苷酸切除修復(fù)酶XPA、XPC的影響。
　　方法：
　　體外培養(yǎng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞 U251，采用攜帶 Wip1基因 RNA干擾載體的慢病毒沉默Wip1基因，并經(jīng)實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證干擾效率。采用陰性對(duì)照病毒感染處理對(duì)照組。然后使用替莫唑胺進(jìn)行化療干預(yù)，將研究分組設(shè)定為NC組、NC+TMZ組、Wip1組和Wip1+TMZ組。最后

9、實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)細(xì)胞XPA、XPC mRNA表達(dá)，免疫印跡檢測(cè)細(xì)胞XPA、XPC蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果：
　?、乓訬C組作為對(duì)照組，設(shè)定其表達(dá)量為1，NC+TMZ組、Wip1（-）組、Wip1（-）+TMZ組的XPA mRNA的相對(duì)表達(dá)量依次為2.12±0.12、0.62±0.08、1.24±0.24。分別與NC組比較，NC+TMZ組和Wip1（-）組差異顯著（P＜0.05），有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。分別與NC+TMZ組比較，Wip1

10、（-）組和Wip1（-）+TMZ組差異顯著（P＜0.05），有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。NC+TMZ組、Wip1（-）組、Wip1（-）+TMZ組的XPC mRNA的相對(duì)表達(dá)量依次為1.79±0.14、0.42±0.11、0.87±0.02。分別與NC組比較，NC+TMZ組和Wip1（-）組差異顯著（P＜0.05），有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。分別與NC+TMZ組比較，Wip1（-）組和Wip1（-）+TMZ組差異顯著（P＜0.05），有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與Wip1（-

11、）組比較，Wip1（-）+TMZ組XPA mRNA的相對(duì)表達(dá)量增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。⑵以NC組作為對(duì)照組，設(shè)定其表達(dá)量為1，NC+TMZ組、Wip1（-）組、Wip1（-）+TMZ組的XPA蛋白相對(duì)表達(dá)量依次為1.44±0.07、0.36±0.04、0.87±0.10；分別與NC組比較，NC+TMZ組和Wip1（-）組差異顯著（P＜0.05），有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。分別與NC+TMZ組比較，Wip1（-）組和Wip1（-）+TMZ組差異顯著

12、（P＜0.05），有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與 Wip1（-）組比較，Wip1（-）+TMZ組XPA蛋白相對(duì)表達(dá)量增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以NC組作為對(duì)照組，設(shè)定其表達(dá)量為1，NC+TMZ組、Wip1（-）組、Wip1（-）+TMZ組的XPC蛋白相對(duì)表達(dá)量依次為1.94±0.12、0.37±0.10、0.64±0.04；分別與NC組比較，NC+TMZ組和 Wip1（-）組差異顯著（P＜0.05），有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與 NC+TMZ組比較， Wip1（

13、-）組XPC蛋白相對(duì)表達(dá)量增高。
　　結(jié)論：
　?、匐S著Wip1基因被沉默，XPA和XPC的mRNA和核內(nèi)蛋白表達(dá)量隨之降低。②替莫唑胺化療干預(yù)能夠增加膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251中XPA，XPC的mRNA和核內(nèi)蛋白的表達(dá)量。③通過(guò)采用shRNA慢病毒感染 U251細(xì)胞，成功構(gòu)建 U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞Wip1基因沉默模型，說(shuō)明此慢病毒載體穩(wěn)定且有效。④靶向沉默Wip1基因聯(lián)合替莫唑胺化療能夠有效抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)， Wip1基因有可能導(dǎo)