上調(diào)miR-130b通過滅活Hippo信號(hào)通路來增強(qiáng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的表型.pdf

1、目的：惡性膠質(zhì)細(xì)胞瘤（GBM，世界衛(wèi)生組織IV級神經(jīng)膠質(zhì)瘤）在成年人中它是最常見的惡性的原發(fā)性腦腫瘤，它是人類最致命的腫瘤之一。盡管在過去幾十年的治療中不斷取得進(jìn)展，但本病的治療及預(yù)后仍然很差，在美國和歐洲地區(qū)5年生存率平均小于3％。最近的研究已經(jīng)表明，在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中，存在著膠質(zhì)瘤干細(xì)胞（CSCs），膠質(zhì)瘤干細(xì)胞能自我分化并不斷的更新增殖成膠質(zhì)瘤細(xì)胞，并導(dǎo)致腫瘤不斷增殖生長。本研究目的就是鑒于此理論基礎(chǔ)，從惡性膠質(zhì)細(xì)胞瘤中分離表達(dá)CD1

2、33的細(xì)胞，通過一系列實(shí)驗(yàn)證實(shí)其是高度致瘤性，并且有很強(qiáng)的侵襲性和耐化療性。然而，對于維持膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的分子機(jī)制在很大程度上仍然未知。有實(shí)驗(yàn)報(bào)道，在維持腫瘤干細(xì)胞的干性上，發(fā)現(xiàn)miRNA起到一定的作用，miRNA是一類長度為19～25個(gè)核苷酸的非編碼單鏈小RNA分子,參與基因轉(zhuǎn)錄后的調(diào)節(jié)，一般通過靶基因的3’端非翻譯區(qū)部分互補(bǔ)配對的結(jié)合方法來調(diào)控目的基因轉(zhuǎn)錄水平。研究表明，Hippo信號(hào)通路起著限制器官大小和抑制腫瘤發(fā)生起至關(guān)重要的作用

3、。生物學(xué)上表明， Hippo信號(hào)通路在很大程度上限制了它的兩個(gè)下游效應(yīng)因子YAP和TAZ。而基因MST1-SAV1的活性直接影響到Y(jié)AP/TAZ的表達(dá)水平。在此，我們通過篩查出miR-130b在膠質(zhì)瘤中的高表達(dá)水平，通過過表達(dá)miR-130b后來檢測Hippo信號(hào)通路中的下游信號(hào)基因的表達(dá)及活性水平，同時(shí)檢測干細(xì)胞標(biāo)志基因，包括CD133、SOX2、Nanog、MYC和BMI1表達(dá)水平，以觀察 miR-130b對膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的影響。這些

4、研究為miR-130b在Hippo信號(hào)通路中的作用，以及miR-130b在膠質(zhì)細(xì)胞瘤的發(fā)展中的作用提供了一種新的機(jī)制，而且為膠質(zhì)瘤的靶向治療提供了一種很好的思路。
　　方法：為了檢測miR-130b在膠質(zhì)瘤組織及細(xì)胞中表達(dá)水平，我們收集膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本8例，正常組織3例。正常細(xì)胞NHA以及膠質(zhì)瘤細(xì)胞SNB19、U87MG、LN444、LN18、U251MG。運(yùn)用BioTNT生物公司miR-130b檢測試劑盒（CL-has-miR-1

5、30b）對標(biāo)本進(jìn)行檢測。同時(shí)我們檢測了miR-130b對膠質(zhì)瘤增殖及膠質(zhì)瘤干細(xì)胞成球的作用，將約500個(gè)細(xì)胞接種在6孔板上以及將約10個(gè)細(xì)胞接種在24孔板上，用無血清的培養(yǎng)基DMEM/F12培養(yǎng)13天，在培養(yǎng)的過種中加入2％B27，同時(shí)加入表皮生長因子20ng/ml，和bFGF20ng/ml，0.4％牛血清白蛋白（BSA）和為5μg/ml的胰島素。進(jìn)行培養(yǎng)后，然后檢測其成球的大小，算出其倍數(shù)。我們運(yùn)用WB方法檢測了miR-130b對Hi

6、ppo信號(hào)通路中YAP、TAZ蛋白表達(dá)的影響，用核蛋白P84抗體作為參照（Sigma美國），同時(shí)檢測MST1和SAV1蛋白水平，用α-Tubulin抗體作為內(nèi)參對照（Sigma美國）。用熒光素酶方法檢測miR-130b對TEAD活性的影響，將購買的TEAD質(zhì)粒在48孔板中共轉(zhuǎn)染膠質(zhì)瘤細(xì)胞，每組設(shè)置4個(gè)復(fù)孔，操作按照LipofectamineTM2000試劑說明書進(jìn)行，48h后進(jìn)行熒光素酶檢測。運(yùn)用miRBASE軟件預(yù)測miR-130b與

7、MST1/SAV1的調(diào)控關(guān)系，軟件預(yù)測miR-130b與MST1/SAV1都存在調(diào)控位點(diǎn)，運(yùn)用熒光素酶的方法，檢測miR-130b與基因 MST1/SAV1是否存在調(diào)控作用，我們構(gòu)建了MST1/SAV13’端，同時(shí)設(shè)計(jì)突變位點(diǎn)，共轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行上機(jī)檢測，測定熒光值。
　　結(jié)果：通過參考癌癥基因GBM miRNA芯片數(shù)據(jù)（TCGA），我們發(fā)現(xiàn)miR-130b水平明顯上調(diào)在人腦膠質(zhì)瘤組織（n=496）與正常腦組織相比（n=10）（P＜0

8、.001）。通過RT-PCR檢測進(jìn)一步驗(yàn)證了這一結(jié)果。miR-130b水平在8例GBM組織相比，與在3例正常腦組織中顯著增加，并與在5種膠質(zhì)細(xì)胞瘤的細(xì)胞系相比，在正常的人星形膠質(zhì)細(xì)胞（NHA）顯著降低。miR-130b對膠質(zhì)瘤增殖及膠質(zhì)瘤干細(xì)胞成球的作用，過表達(dá)miR-130b有力促進(jìn)懸浮培養(yǎng)產(chǎn)生大約兩倍以上的細(xì)胞球。相反， mir-130b-抑制細(xì)胞形成的球體不及正常球體的2倍，我們的研究結(jié)果表明，miR-130b促進(jìn)膠質(zhì)細(xì)胞瘤成球的

9、作用。WB法檢測蛋白的表達(dá)水平得知，過表達(dá)miR-130b使YAP、TAZ的表達(dá)增高，而抑制miR-130b的表達(dá)可以使蛋白YAP、TAZ的表達(dá)降低，而核因子P84的表達(dá)卻沒有影響，而過表達(dá)miR-130b后，MST1和SAV1蛋白水平降低，這說明miR-130b直接影響了Hippo信號(hào)通路基因而發(fā)揮相關(guān)功能作用。熒光素酶進(jìn)一步驗(yàn)證了在過表達(dá)miR-130b的穩(wěn)定細(xì)胞株SNB19和LN18中，干擾YAP和TAZ的情況下，與陽性對照的順鉑

10、對比，檢測的熒光值為1、0.25、0.28和1、0.26、0.39，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。
　　結(jié)論：YAP與TAZ均與TEAD有顯著的作用，其降低TEAD的活性比順鉑還要強(qiáng)。由mirBASE軟件預(yù)測miR-130b與MST1/SAV1有調(diào)控位點(diǎn)，通過熒光素酶檢測提示miR-130b與 MST1/SAV1-3'UTR測得的熒光值顯著降低，說明它們之間有結(jié)合點(diǎn)，減弱了熒光的表達(dá)，而在對照及正常組中，熒光的值沒有什么變化，