核結合因子在成骨細胞中的表達及其促骨髓間質細胞凋亡的作用機制研究.pdf

1、核結合因子在成骨細胞中的表達及其促骨髓間質細胞凋亡的作用機制研究第一部分：核結合因子(Cbfa1)在不同細胞系中表達的比較。目的：觀察核結合因子(Cbfa1)在人成骨肉瘤MG63細胞、人成骨肉瘤Soas-2細胞、成人原代成骨細胞、小鼠骨髓間質細胞MBA-1、小鼠前成骨細胞MC3T3E1、小鼠破骨前細胞RW264.7和人軟骨前體細胞SW1353中的表達，明確Cbfa1及其亞型在骨骼系統(tǒng)不同細胞系中的表達狀態(tài)，及在代表不同成骨細胞發(fā)育階段細

2、胞系的中表達差異，探討Cbfa1及其亞型表達與成骨細胞發(fā)育階段之間的關系。 方法：從正常骨折病人骨組織中分離人成骨細胞。按細胞種系來源分兩組，分別用半定量RT-PCR觀察Cbfa1mRNA在小鼠來源(小鼠骨髓間質細胞、成骨前細胞、破骨前體細胞)及在人類來源(人成骨肉瘤細胞、成人原代成骨細胞、人軟骨前體細胞)細胞中的表達。小鼠來源的細胞系還觀察Cbfa1兩種亞型Cbfa1/P56、Cbfa1/P57的表達。用Western-blo

3、t檢測各種細胞中Cbfa1蛋白的表達。用FITC+DAPI觀察Cbfa1蛋白在成人原代成骨細胞和小鼠骨髓間質細胞MBA-1中表達的亞細胞定位。 結論：Cbfa1mRNA的表達可能與成骨細胞的分化階段有關，小鼠來源的細胞系中以Cbfa1/P57亞型為主。Cbfa1蛋白的表達定位于細胞核內。 第二部分MC3T3E1細胞分化過程中核結合因子(Cbfa1)及各相關基因的表達目的：研究在小鼠前成骨細胞MC3T3E1誘導成骨過程中，

4、總Cbfa1及Cbfa1兩種亞型Cbfa1/P56、Cbfa1/P57的表達隨成骨細胞成熟過程的表達變化，觀察堿性磷酸酶、Ⅰ型膠原、骨鈣素、骨涎蛋白、骨橋素及與Cbfa1相關的兩種轉錄因子MSX2、OSX在成骨細胞成熟過程中的變化。 方法：MC3T3E1細胞在β-甘油磷酸鈉，抗壞血酸存在的情況下培養(yǎng)22天，在細胞培養(yǎng)的不同時間(0，4，10，14，18，22天)，用α-磷酸奈酚法測定堿性磷酸酶活性，半定量RT-PCR檢測總Cbf

5、a1mRNA及Cbfa1兩種亞型Cbfa1/P56、Cbfa1/P57mRNA和Ⅰ型膠原、骨鈣素、骨涎蛋白、骨橋素mRNA以及MSX2、OSXmRNA的表達；用Western-blot檢測MC3T3E1細胞成熟過程中不同時間點Cbfa1蛋白的表達；VanGieSon苦味酸酸性復紅染色法染色細胞Ⅰ型膠原；茜素紅染色觀察礦化結節(jié)形成。 結論：在MC3T3E1細胞的分化過程中，培養(yǎng)的第10天以前為細胞增殖期，培養(yǎng)的第10天到第22天為

6、骨基質形成并成熟礦化期。Cbfa1mRNA及Cbfa1蛋白的表達隨成骨細胞的分化逐漸增高，以Cbfa1/P57mRNA亞型為主。Ⅰ型膠原、骨鈣素、骨涎蛋白、骨橋素、OSX、MSX2mRNA隨成骨細胞分化表達逐漸增高。 第三部分核結合因子(Cbfa1)誘導骨髓間質細胞MBA-1凋亡目的：研究Cbfa1的兩種N末端亞型Cbfa1/P56、Cbfa1/P57對骨髓間質細胞MBA-1凋亡的影響，探討Cbfa1介導MBA-1細胞凋亡的機制

7、。 方法：將帶有Cbfa1/P56、Cbfa1/P57全長cDNA的質粒用脂質體方法瞬時轉染到人骨髓間質細胞MBA-1細胞中，造成MBA-1細胞的Cbfa1高表達，72小時后用流式細胞儀觀察細胞凋亡率的變化，DAPI+FITC染色觀察細胞核的變化，并抽提蛋白進行Cbfa1及相關凋亡蛋白Bax、Bcl-2、Cytochrome-C、Caspase-3、Caspase-9和TNF-a的免疫印跡檢測。 結論：Cbfa1兩個N末