慢性心理應激影響大鼠細胞自噬功能的時相性研究.pdf

1、目的:
　　把慢性心理應激與中醫(yī)情志病聯(lián)系起來，根據中醫(yī)七情內傷，最先傷肝的病因理論，觀測比較不同的慢性心理應激時間所導致的病位演變及證候變化規(guī)律，以及海馬神經細胞、肝細胞等體細胞內自噬活動的變化情況。為下一步中醫(yī)藥抗應激損傷的動物實驗研究摸索最佳造模時間，也為從細胞自噬角度闡釋肝主疏泄的藏象理論提供實驗依據。
　　方法:
　　根據曠場實驗5分鐘活動距離，大鼠隨機分為空白組、造模10天組、造模20天組、造模30天組和造

2、模40天組5組，六種造模方法（禁食、禁水、冰水游泳、夾尾、電擊、束縛）隨機安排在實驗過程中，以曠場實驗判斷慢性心理應激模型的建立時間，酶聯(lián)免疫法分析大鼠血清胃動素、胃泌素，慢性心理應激對大鼠海馬CA1區(qū)神經細胞自噬體的影響，慢性心理應激對大鼠海馬神經細胞、肝細胞自噬相關蛋白表達的影響。
　　結果:
　　1、慢性心理應激對大鼠空間記憶及學習能力和抑郁情緒的影響
　　各組大鼠造模前曠場實驗活動總路程無差異（P＞0.05）。

3、造模后，與空白組相比，5分鐘活動總路程造模10天組距離縮短，但無差異（P＞0.05）;造模20天組活動距離明顯縮短，有差異（P＜0.05）;造模30天組、40天組活動距離縮短，有明顯差異(P＜0.01)。前3分鐘活動總路程，與空白組相比，造模10天組活動距離縮短，有差異（P＜0.05）;造模20天組、造模30天組、40天組活動距離明顯縮短，有顯著差異(P＜0.01)。
　　2、慢性心理應激對大鼠胃腸激素的影響
　　各組大鼠造

4、模結束后取血，測定血清胃動素、胃泌素，與空白組相比，造模10天組血清胃動素下降，有差異（P＜0.05）;造模20天組、30天組、40天組胃動素下降明顯，有顯著差異（P＜0.01）。與空白組比較，造模10天組、20天組血清胃泌素下降，但無差異（P＞0.05）;造模30天組、40天組下降明顯，與空白組相比有差異（P＜0.05）。而且隨著造模時間的延長，大鼠血清胃腸激素呈逐步下降趨勢。
　　3、慢性心理應激對大鼠細胞自噬相關指標表達的影

5、響
　　3.1慢性心理應激對大鼠細胞自噬相關蛋白TSC2的影響
　　各組大鼠造模結束后取材進行倒置顯微鏡觀察，免疫組化染色后細胞質顯示黃褐色，核呈現(xiàn)藍色?？瞻捉M大鼠海馬區(qū)顯示，黃色區(qū)域分布少，造模10天組與空白組相比陽性表達率上升，但無差異(P＞0.05);造模20天組與空白組陽性表達率相比，上升，有差異（P＜0.05）;空白組與造模30天組、40天組相比有顯著差異（P＜0.01）?？瞻捉M大鼠肝索清楚，細胞形態(tài)清晰，造模10

6、天組與空白組相比陽性表達率上升，無差異(P＞0.05);造模20天組、30天組、40天組與空白組相比有顯著差異(P＜0.01)。
　　3.2慢性心理應激對大鼠細胞自噬相關蛋白ULK1的影響
　　海馬神經細胞中ULK1的表達，造模10天組與空白組相比陽性表達率上升，但無差異(P＞0.05)，造模20天組與空白組陽性表達率相比，上升，有差異（P＜0.05）;空白組與造模30天組、40天組相比有顯著差異（P＜0.01）?？瞻捉M大鼠

7、肝索清楚，細胞形態(tài)清晰，造模10天組與空白組相比陽性表達率上升，但無差異（P＞0.05）;造模20天組與空白組陽性表達率相比，上升，有差異(P＜0.05);造模30天組、40天組與空白組陽性表達率相比有顯著差異(P＜0.01)。
　　4、慢性心理應激對大鼠海馬CA1區(qū)自噬體的影響
　　各組大鼠造模結束后取材進行透射電子顯微鏡觀察，比較海馬細胞內的結構，空白組大鼠可見海馬神經細胞胞壁完整，胞漿充盈，細胞形態(tài)清晰，無腫脹壞死，有

8、少數(shù)自噬體可見;造模10天組海馬神經細胞胞壁相對完整，胞漿充盈，腫脹壞死較少，細胞的結構形態(tài)清晰，自噬體數(shù)量少;造模20天組海馬神經細胞胞壁較完整，胞漿相對充盈，腫脹壞死少，可見少量自噬體;造模30天組海馬神經細胞胞壁不完整，胞漿少，腫脹壞死，雙層膜包裹的自噬體數(shù)量較多，內含待降解物;造模40天組海馬神經細胞胞壁破壞，腫脹壞死，可見大量雙層膜包裹的自噬體或自噬溶酶體，胞質模糊不清，含有較多待降解物，核內染色體彌散不清?？瞻捉M大鼠海馬CA

9、1區(qū)的自噬體數(shù)目明顯少于造模組，與造模10天組無差異（P＞0.05），與造模20天組有差異（P＜0.05），與造模30天組、40天組有明顯差異（P＜0.01），空白組自噬體數(shù)目最少，而造模40天組自噬體數(shù)目最多。
　　結論:
　　曠場實驗有效的測定了慢性心理應激的造模時間，慢性心理應激影響大鼠的學習記憶能力并出現(xiàn)情緒抑郁，曠場實驗中，應激時間越長，抑郁越嚴重，曠場活動距離越短。通過對曠場實驗活動距離的測定及比較，將造模30天

10、作為慢性心理應激最佳時間。
　　慢性心理應激可以影響胃腸激素的釋放，不同的造模時間下，胃腸激素水平不同。造模時間的延長，應激的加劇，胃腸激素水平下降。慢性心理應激影響了肝主疏泄功能的正常發(fā)揮，導致肝失疏泄，“見肝之病，知肝傳脾”，肝病傳脾，使脾胃受損，功能失調。因此，慢性心理應激隨著時間的延長，證候可能發(fā)生變化，由肝郁氣滯向肝郁脾虛轉化。
　　慢性心理應激影響海馬CA1區(qū)細胞自噬，引起自噬的過度激活，造成該區(qū)細胞的損傷。隨著