發(fā)散式?jīng)_擊波促進骨髓間充質(zhì)干細胞增殖特性的實驗研究.pdf

1、目的:通過應(yīng)用低能量發(fā)散式?jīng)_擊波(rESW)對兔骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSC)進行直接刺激，觀察發(fā)散式?jīng)_擊波對BMSC增殖特性的影響。本研究從BMSC對沖擊波刺激的反應(yīng)出發(fā)，探求發(fā)散式?jīng)_擊波促進關(guān)節(jié)軟骨損傷修復(fù)的理論基礎(chǔ)和作用機制。
　　方法:在細胞實驗部分，采用差速離心法和懸浮貼壁法從2～3月齡的新西蘭白兔的脛骨骨髓中培養(yǎng)原代BMSC，培養(yǎng)至P4～P6代。分別從形態(tài)學(xué)、表面分子和分化能力（成脂、成骨）等方面對BMSC進行鑒定。用不

2、同劑量的發(fā)散式?jīng)_擊波對懸浮的BMSC進行直接刺激，根據(jù)沖擊波劑量對實驗進行分組，分為0bar/1 bar/2 bar/3 bar四組(Bar為沖擊波壓力單位)。對沖擊波刺激組與對照組的BMSC分別進行CCK-8檢測和CFU-F檢測比較其增殖活性，用統(tǒng)計學(xué)軟件對實驗結(jié)果進行統(tǒng)計學(xué)分析。在動物實驗部分，我們使用與之前實驗等月齡的新西蘭白兔制作膝關(guān)節(jié)軟骨缺損模型，將每只兔子的左側(cè)膝關(guān)節(jié)設(shè)為實驗組，右側(cè)膝關(guān)節(jié)設(shè)為對照組。實驗組采用微骨折加2 b

3、ar沖擊波進行干預(yù)，而對照組只采用微骨折術(shù)。手術(shù)后24小時將骨髓等量沖出進行體外CFU-F實驗，在不同時間點對比BMSC增殖聚集情況。在對數(shù)據(jù)結(jié)果進行分析統(tǒng)計時，使用SPSS16.0軟件并使用ImageJ軟件對圖像進行處理分析。
　　結(jié)果:通過骨髓分離技術(shù)我們可以獲得原代BMSC，在倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，類似成纖維細胞樣聚集分布。在表面分子分析中，BMSC缺乏典型的造血細胞抗原CD45分子、CD14分子，也不表達CD79α

4、和CD90，高表達CD45和CD81。在誘導(dǎo)分化實驗中，BMSC可以被成功誘導(dǎo)為骨細胞、脂肪細胞，通過相應(yīng)的染色得到證實，并檢測相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子表達。經(jīng)不同的沖擊波進行刺激后，BMSC表現(xiàn)出不同的增殖特性。無論是CCK-8檢測還是CFU-F檢測，沖擊波刺激組都明顯優(yōu)于對照組，并且2Bar時其效應(yīng)最強，其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。在動物體內(nèi)實驗進行CFU-F檢測中，對術(shù)后24小時分離的MSC培養(yǎng)，并于第8天、11天、15天進行CFU-F檢測，結(jié)果顯

5、示實驗組增殖活性均優(yōu)于對照組，其結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)論:
　　1.發(fā)現(xiàn)兔BMSC在表面分子檢測中CD90為陰性，這是與以往文獻中的報道是不同的。
　　2.發(fā)散式?jīng)_擊波體外刺激BMSC具有促進其增殖和聚集作用，在沖擊波劑量為2bar時其促增值作用最強。
　　3.發(fā)散式?jīng)_擊波對BMSC的作用呈現(xiàn)劑量相關(guān)性，其對于沖擊波的軟骨修復(fù)劑量具有指導(dǎo)作用。
　　4.在動物實驗中，采用微骨折術(shù)配合沖擊波進行軟骨缺損