紅色毛癬菌對角質(zhì)形成細(xì)胞VDR與IL-10、IL-12表達(dá)的影響及相關(guān)關(guān)系的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　有研究顯示，人類對紅色毛癬菌普遍易感，全球90％的皮膚癬菌病是由紅色毛癬菌引起的，發(fā)病高峰集中在夏季，大多不引起明顯的炎癥反應(yīng),而呈現(xiàn)為慢性遷延病程，嚴(yán)重影響著患者生活質(zhì)量[1]。
　　維生素D是一類固醇類衍生物，可對人體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生重要的影響，其作用越來越受到人們的關(guān)注[2]，維生素D通過與維生素D受體(VDR)結(jié)合發(fā)揮生理作用。VDR屬于類固醇激素/甲狀腺激素受體超家族成員，是一種配體依賴的核轉(zhuǎn)錄因子。

2、>　　皮膚是機(jī)體內(nèi)所需維生素D的重要源泉，可以在太陽光的照射下由皮膚內(nèi)儲(chǔ)備的前體物質(zhì)維生素D3原轉(zhuǎn)化而來。維生素D的活性形式1,25(OH)2D3，在夏季血清水平較冬季為高，夏季維生素D的存貯有一個(gè)上升趨勢，這可導(dǎo)致前炎癥因子的下降，從而導(dǎo)致機(jī)體對病原微生物產(chǎn)生免疫耐受。
　　IL-12是一種異二聚體促炎因子，可通過誘導(dǎo)γ干擾素的產(chǎn)生、促進(jìn)Th1細(xì)胞的分化，起到強(qiáng)大的促炎癥作用[3]。IL-10可對多種免疫細(xì)胞的生物活性及這些細(xì)胞

3、釋放的細(xì)胞因子的生物效應(yīng)產(chǎn)生抑制作用，其生理功能就是限制和終止炎癥反應(yīng)。因此，IL-10在限制宿主對病原菌的免疫過程中起重要作用[4,5]。本實(shí)驗(yàn)通過紅色毛癬菌體外刺激角質(zhì)形成細(xì)胞，檢測VDR與IL-10、IL-12的表達(dá)并對其表達(dá)水平進(jìn)行相關(guān)分析，進(jìn)而探討紅色毛癬菌感染過程中是否通過VDR信號途徑介導(dǎo)機(jī)體對紅色毛癬菌的免疫耐受導(dǎo)致疾病慢性遷延。
　　方法：
　　1實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞的培養(yǎng)
　　HaCaT細(xì)胞購自上海賽笠生物科

4、技有限公司編號：MXC138。
　　HaCaT細(xì)胞的培養(yǎng)使用90%DMEM+10%FBS+1%青鏈霉素混合劑配制而成的完全培養(yǎng)基。將HaCaT細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液后，進(jìn)行細(xì)胞爬片，培養(yǎng)5天后，取出爬片，丙酮固定，進(jìn)行HE染色及免疫組織化學(xué)SP法檢測HaCaT細(xì)胞角蛋白10的表達(dá)。
　　2實(shí)驗(yàn)用菌株
　　實(shí)驗(yàn)菌株采用河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院真菌室保存菌種。
　　3菌株的培養(yǎng)及菌懸液的配制
　　將紅色毛癬菌在PDA上

5、活化三次，28℃培養(yǎng)7—14天。加入含0.1%吐溫80的無菌水，吹打混合均勻，然后用組織研磨器將菌懸液研磨，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，調(diào)整濃度為4-6×105CFU/mL。
　　4實(shí)驗(yàn)分組與處理
　　實(shí)驗(yàn)分為對照組和實(shí)驗(yàn)組。
　　將HaCaT細(xì)胞培養(yǎng)1周后取出，棄原培養(yǎng)基，PBS洗滌3遍后，用0.25%胰蛋白酶將細(xì)胞從培養(yǎng)瓶底部消化下來，加入完全培養(yǎng)基終止消化，離心所收集到的細(xì)胞，用完全培養(yǎng)基調(diào)終濃度至1-2×106/mL，轉(zhuǎn)種

6、到24孔培養(yǎng)板中。繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)后行分組處理。實(shí)驗(yàn)組每孔中加入濃度為4-6×105CFU/mL的菌懸液1mL，對照組每孔加入1mL含0.1%吐溫80無菌水1mL。依次在2h、4h、8h、16h采集實(shí)驗(yàn)組和對照組的上清液。-20℃凍存待測。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)均設(shè)3個(gè)平行孔。
　　5 ELISA法測各組IL-10、IL-12的分泌水平
　　復(fù)溫實(shí)驗(yàn)組和對照組所收集到的上清液，依照所購買試劑盒使用指南，分別測定細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的IL-1

7、0、IL-12表達(dá)水平。
　　6 Western blot法測各組 VDR的表達(dá)水平
　　PBS溶液清洗長有HaCaT細(xì)胞的24孔板，刮下細(xì)胞轉(zhuǎn)移至EP管內(nèi)，離心后添加裂解液RIPA裂解細(xì)胞，提取總蛋白，SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)至 PVDF膜，脫脂牛奶封閉完成之后，分別孵育 VDR(1:1000)與β-actin(1:1000)一抗及山羊抗兔/小鼠IgG二抗(1:3000)，最后用雙色紅外激光掃描儀進(jìn)行掃膜，Image

8、J軟件分析結(jié)果。
　　7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件，所得結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較所使用的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法是單因素方差分析,組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)的兩兩比較所使用的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法為SNK-q檢驗(yàn)，VDR與IL-10、IL-12的相關(guān)性分析所使用的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法為Pearson相關(guān)分析法，P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1 HaCaT細(xì)胞培養(yǎng)的形態(tài)學(xué)觀察
　　倒置顯微鏡下觀察，細(xì)胞生長狀態(tài)良

9、好，多數(shù)細(xì)胞貼壁，折光性強(qiáng)，圓形，細(xì)胞膜完整并且向外伸出2至3個(gè)偽足。5天后細(xì)胞呈現(xiàn)多角形，融合成片，外觀呈鋪路石樣排列。HaCaT細(xì)胞HE染色結(jié)果可見其胞質(zhì)豐富，呈粉紅色，核大呈藍(lán)紫色。免疫組化結(jié)果顯示HaCaT細(xì)胞的角蛋白10在胞膜及胞質(zhì)中呈陽性表達(dá)。
　　2上清液IL-10表達(dá)水平的ELISA法測定結(jié)果
　　在實(shí)驗(yàn)的2h、4h、8h、16h，實(shí)驗(yàn)組IL-10表達(dá)水平分別為1427.71±15.952、1562.09±1

10、2.24、1826.57±16.12、2363.807±53.465pg/mL，IL-10的表達(dá)水平隨著時(shí)間的延長而增加。對照組在2h、4h、8h、16h的IL-10表達(dá)水平分別為1100.58±2.46、1160.8±7.044、1285.07±5.185、1400.96±11.657pg/mL，IL-10的表達(dá)水平隨著時(shí)間的延長而增加。IL-10在實(shí)驗(yàn)組的表達(dá)水平比對照組高，F(xiàn)=6.591，P=0.042(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)

11、學(xué)意義。
　　3上清液IL-12表達(dá)水平的ELISA法測定結(jié)果
　　在實(shí)驗(yàn)的2h、4h、8h、16h，實(shí)驗(yàn)組IL-12表達(dá)水平分別為296.85±0.6、285.43±2.03、275.19±6.03、249.18±3.72 pg/mL，IL-12的表達(dá)水平隨著時(shí)間的延長而減少。對照組在2h、4h、8h、16h的IL-12表達(dá)水平分別為294.85±4.601、317.36±7.026、340.123±18.905、385.

12、050±6.593 p g/mL，IL-12的表達(dá)水平隨著時(shí)間的延長而增加。實(shí)驗(yàn)組的IL-12表達(dá)水平明顯低于對照的IL-12表達(dá)水平，F(xiàn)=7.012，P=0.038(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　4 Western Blot法測人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞(HaCaT)中VDR蛋白的表達(dá)水平
　　在實(shí)驗(yàn)的2h、4h、8h、16h，實(shí)驗(yàn)組VDR蛋白表達(dá)水平灰度比值分別為0.394±0.011、0.468±0.019、0.4

13、58±0.021、0.616±0.156。對照組在2h、4h、8h、16h的VDR蛋白表達(dá)水平分別為0.27±0.014、0.294±0.015、0.301±0.002、0.413±0.01。實(shí)驗(yàn)組和對照組的VDR蛋白表達(dá)水平均隨時(shí)間的延長而表達(dá)增加，但實(shí)驗(yàn)組VDR蛋白上升的水平高于對照組，F(xiàn)=8.404，P=0.027(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　5紅色毛癬菌作用于HaCaT細(xì)胞后VDR的表達(dá)水平分別與IL-10、I

14、L-12的表達(dá)水平的相關(guān)分析結(jié)果
　　Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示VDR蛋白表達(dá)水平與IL-10表達(dá)水平呈正相關(guān)，r=0.955，P=0.045(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。VDR蛋白表達(dá)水平與IL-12表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，r=-0.968,P=0.032(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論：
　　1紅色毛癬菌刺激角質(zhì)形成細(xì)胞后，IL-10的表達(dá)水平呈時(shí)間依賴性上升趨勢，IL-12的表達(dá)水平呈時(shí)間依賴性

15、下降趨勢。
　　2紅色毛癬菌刺激角質(zhì)形成細(xì)胞后，VDR蛋白表達(dá)呈時(shí)間依賴性上升趨勢。
　　3紅色毛癬菌刺激角質(zhì)形成細(xì)胞后，VDR表達(dá)與IL-10的表達(dá)呈正相關(guān)，而與IL-12的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。
　　綜上所述，紅色毛癬菌刺激角質(zhì)形成細(xì)胞后，隨作用時(shí)間的延長， VDR及IL-10表達(dá)上升，而IL-12表達(dá)下降。推測紅色毛癬菌可能通過VDR途徑促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞分泌IL-10以及抑制IL-12表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致機(jī)體對紅色毛癬菌產(chǎn)生免