TLR2對角質(zhì)形成細胞與不同皮膚癬菌共孵育時的影響研究.pdf

1、第一部分角質(zhì)形成細胞對不同皮膚癬菌生長的抑制作用及封閉TLR2對其的影響
　　目的：
　　研究角質(zhì)形成細胞對紅色毛癬菌、犬小孢子菌及石膏樣小孢子菌生長的抑制作用以及封閉TLR2對上述作用的影響。
　　方法：
　　將培養(yǎng)在含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中的角質(zhì)形成細胞在5%CO2、37℃環(huán)境下進行孵育,當細胞生長到80%左右時分為兩組,以無血清培養(yǎng)基配置的菌絲懸液(懸液濃度為4×105/ml)替代原培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)

2、為刺激組(即A組),阻斷組(即B組)則先加入TLR2抗體(使抗體濃度達到20ug/ml),37℃孵育1小時以阻斷TLR2的作用,再加入菌懸液,同時設(shè)立無細胞生長的培養(yǎng)基加入菌絲段懸液為空白對照。分別制備在不同時間點(4h、8h、16h和24h)共孵育后的菌絲段懸液,通過臺盼藍染色計數(shù)法計算得出真菌的生長抑制率。
　　結(jié)果：
　　在角質(zhì)形成細胞和菌絲段懸液共孵育的不同時間點,采用臺盼藍染色計數(shù)法檢測的結(jié)果為:紅色毛癬菌刺激組生

3、長抑制作用4h即顯現(xiàn),16h可達(67.8%±3.1%),封閉TLR2后的阻斷組生長抑制作用減弱,封閉前后生長抑制作用差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);刺激組犬小孢子菌4h生長抑制率為41.8%±2.5%,隨時間推移,16h達70.0%±6.8%,24h逐漸下降,封閉TLR2后的阻斷組在各時間點生長抑制作用均明顯下降,阻斷前后生長抑制作用差異皆有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);刺激組石膏樣小孢子菌隨共孵育時間的延長生長抑制作用逐漸加強,24

4、h達63.0%±3.5%,封閉TLR2阻斷組4h生長抑制率為15.6%±1.7%,且各個時間點生長抑制作用均減弱,阻斷前后差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　結(jié)論：
　　角質(zhì)形成細胞與體外培養(yǎng)的親人性紅色毛癬菌、親動物性犬小孢子菌及親土性石膏樣小孢子菌共孵育時對其均有抑制作用;阻斷TLR2后此抑制作用明顯減弱,TLR2在角質(zhì)形成細胞抑制不同皮膚癬菌生長的過程中產(chǎn)生重要的影響。
　　第二部分TLR2在不同皮膚癬菌感染

5、中對角質(zhì)形成細胞分泌炎癥細胞因子的影響
　　目的：
　　觀察紅色毛癬菌、犬小孢子菌及石膏樣小孢子菌與角質(zhì)形成細胞共孵育后炎癥細胞因子IL-6、IL-8及TNF-α的表達變化,以及中和TLR2前后上述因子的變化情況,探討TLR2在皮膚癬菌感染中發(fā)揮的作用。
　　方法：
　　角質(zhì)形成細胞與上述三種皮膚癬菌菌懸液分別共孵育,角質(zhì)形成細胞直接與懸液共孵育為刺激組(即A組),阻斷組(即B組)為先阻斷TLR2后角質(zhì)形成細胞再

6、與三種皮膚癬菌共孵育,采用酶聯(lián)免疫復(fù)合物法(ELISA)檢測不同時間點細胞上清中IL-6、IL-8及TNF-α的濃度,比較中和TLR2抗體前后各種細胞因子的濃度變化情況,同時設(shè)置陰性對照。
　　結(jié)果：
　　紅色毛癬菌刺激角質(zhì)形成細胞后刺激組IL-8濃度明顯升高,在各時間點分別與對照組、阻斷組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);刺激組IL-6及TNF-α濃度8h分泌明顯增加,且隨時間延長其濃度不斷升高,24h分別達(498.

7、133±20.159)pg/ml和(32.133±3.674)pg/ml,與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),封閉TLR2阻斷組IL-6及TNF-α濃度下降,刺激組和阻斷組8h、16h和24h差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　犬小孢子菌刺激角質(zhì)形成細胞后IL-8表達量隨時間推移逐漸增多,4h濃度即可達到(542.867±37.846)pg/ml,24h升高到(671.358±26.247)pg/ml,阻斷TLR2

8、后則表達明顯降低,各時間點刺激組與對照組、刺激組與阻斷組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);刺激組IL-6、TNF-α在4h及8h時濃度無顯著變化,16小時后分泌量明顯增加,且隨時間推移逐漸增多,阻斷TLR2后各時間點IL-6、TNF-α表達降低,其中16h和24h時刺激組與阻斷組、刺激組與對照組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　石膏樣小孢子菌刺激角質(zhì)形成細胞后刺激組IL-8濃度在各時間點均升高,分別與對照組及阻斷組之間

9、差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);刺激組IL-6不同時間點動態(tài)表達量不同,4h和8h刺激組與對照組、刺激組與阻斷組比較無明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05),而在16h和24h時刺激組濃度分別可達到(38.70±8.41)pg/ml、(51.70±10.32)pg/ml,與阻斷組及對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);刺激組TNF-α濃度16h方升高明顯,24h達(40.61±5.94)pg/ml,與阻斷組及對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義