地西他濱、三氧化二砷對HL-60細胞端粒酶活性影響的實驗研究.pdf

1、目的：急性髓系白血病(acute myeloid leukemia, AML)是一類造血干細胞惡性克隆性疾病，是嚴重威脅人類健康的疾病。AML主要的治療方法為化療，近年來成人 AML患者經(jīng)標準“3+7”化療方案治療后，完全緩解率在70％-80％。同時由于微小殘留病灶（MRD）的存在，緩解后復(fù)發(fā)是AML病人的危險因素。只有近20％-30％的AML病人可以獲得無病生存［件1］。異基因造血干細胞移植是治療AML最有效的方法，由于患者客觀條限制

2、較多（如供著來源、經(jīng)濟狀況）等多方面的因素，目前能夠接受造血干細胞移植的AML病人為少數(shù)。因此尋找新的靶向藥物提高化療藥物的效果是我們不斷探索的領(lǐng)域。急性髓系白血病的發(fā)生與細胞遺傳學、分子遺傳學改變有密切關(guān)系，研究發(fā)現(xiàn)大多數(shù)急性髓系白血病（AML）患者中存在2種或2種以上基因異常甲基化，DNA甲基化在白血病中廣泛存在，啟動子CpG島超甲基化導致的抑癌基因失活與白血病的發(fā)生和腫瘤細胞化療藥物抵抗密切相關(guān)。
　　地西他濱(decita

3、bine,DAC)，又稱為5-氮雜-2’-脫氧胞苷，是一種胞嘧啶核苷類似物，為特異的DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑，是目前研究較多的甲基化抑制劑，可通過逆轉(zhuǎn)C p G島甲基化，使多種因甲基化而失活的抑癌基因重新表達，抑制腫瘤細胞生長而達到治療腫瘤的目的。三氧化二砷(arsenictroide,AS2O3)是傳統(tǒng)中藥砒霜的有效成分之一，是治療急性早幼粒細胞白血病的經(jīng)典藥物之一，該藥物通過誘導白血病細胞分化及凋亡兩條途徑發(fā)揮其治療作用，隨著對該藥

4、物的不斷研究，現(xiàn)在逐漸應(yīng)用于其他類型的惡性血液病的治療中。
　?。?］目前去甲基化藥物不斷應(yīng)用于臨床，不僅應(yīng)用于骨髓增生異常綜合征的患者，同時針對老年AML、復(fù)發(fā)、難治的AML患者，有一定的效果。研究新的靶向藥物，以提高藥物療效并延長無病生存期是目前研究的重要課題。本實驗研究DAC、AS2O3對HL-60細胞(人急性髓系白血病細胞株)增殖、凋亡的作用以及對HL-60細胞端粒酶的基因及蛋白表達水平變化的的影響，探討去甲基化藥物對AM

5、L的作用機制，旨在為今后臨床用藥提供更多的理論依據(jù)。
　　方法：
　　選取HL-60（人急性髓系白血?。┘毎隇檠芯繉ο螅瑢嶒炿S機分組：設(shè)置未加藥物空白對照組，單藥DAC組(1μmol/L、10μmol/L、50μmol/L)，單藥 AS2O3組(1.25μmol/L、2.5μmol/L、5μmol/L)、DAC聯(lián)合 AS2O3組(10μmol/L+2.5μmol/L、10μmol/L+5μmol/L、50μmol/L+2.

6、5μmol/L、50μmol/L+5μmol/L)，DAC（50μmol/L）預(yù)處理+AS2O3組(1.25μmol/L、2.5μmol/L、5μmol/L)。根據(jù)不同濃藥物度作用 HL-60細胞后，檢測不同時間增殖、凋亡的作用以及對端粒酶基因及蛋白表達水平的影響。每組實驗重復(fù)3次。
　　1用CCK8法篩查藥物濃度，檢測不同藥物濃度作用HL-60細胞24h、48h、72h后的增殖抑制率；
　　2用流式細胞術(shù)(FCM)檢測不同

7、藥物濃度作用HL-60細胞24h、48h、72h后的凋亡率；
　　3用RT-PCR法檢測不同藥物濃度作用HL-60細胞48h后端粒酶的hTERT mRNA表達水平的變化；
　　4用Western Blot法檢測不同藥物濃度作用HL-60細胞48h后hTERT的蛋白表達水平的變化；
　　5用SPSS21.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學處理。所有數(shù)據(jù)用3次獨立實驗的平均值表示，實驗結(jié)果均采用均數(shù)±標準差(X±S)表示；兩組比較應(yīng)用t

8、檢驗，多組比較應(yīng)用方差分析，P<0.05有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)果：
　　1 DAC、AS2O3單藥對HL-60細胞株增殖抑制率的檢測。
　　1.1不同濃度DAC、AS2O3單藥作用于HL-60細胞24h、48h、72h后，單藥DAC、AS2O3增加藥物濃度和作用時間延長，可增加增殖抑制率。單藥DAC作用HL-60細胞后，增殖抑制率由(10.85±2.04)%增加到(56.01±2.04)%，單藥AS2O3作用HL-60

9、細胞后，增殖抑制率由(14.55±1.68)%增加到(85.09±3.67)%。各藥物處理組之間比較差異有統(tǒng)計學意義（P=0.00）。說明DAC、AS2O3單藥均對HL-60細胞有抑制增殖的作用，并呈時間-劑量依賴性。(圖1,圖2，表1,表2)
　　1.2 DAC聯(lián)合AS2O3對HL-60細胞作用24h、48h、72h后，不同時間段兩藥聯(lián)合作用 HL-60細胞，增加藥物聯(lián)合濃度，其增殖抑制率由(35.68±1.98)%增加到(94

10、.89±1.02)%，各聯(lián)合處理組與單藥處理組比較增殖抑制率明顯增高，比較有統(tǒng)計學意義(P=0.00)。說明 DAC聯(lián)合 AS2O3對HL-60細胞的抑制作用優(yōu)于單藥。(圖3，表3）
　　1.3經(jīng)DAC(50μmol/L)預(yù)處理后，不同濃度AS2O3對HL-60細胞作用24h、48h、72h后，增加藥物濃度和延長作用時間，可增強增殖抑制率，增殖抑制率由(26.98±0.67)%增加到(93.10±0.80)%，與 AS2O3單藥組

11、比較增殖抑制率顯著增加，各藥物處理組間及與AS2O3單藥組之間比較差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.00)。說明DAC預(yù)處理可以增強AS2O3對HL-60細胞的增殖抑制作用。(圖4，表4)
　　2 DAC、AS2O3單藥對HL-60細胞株凋亡的影響
　　2.1單藥DAC、AS2O3作用于HL-60細胞24h、48h、72h后，凋亡率逐漸升高。單藥 DAC對 HL-60細胞凋亡率由(7.61±1.02)%增加到(36.33±0.51

12、)%，單藥 AS2O3對 HL-60細胞凋亡率由(9.80±0.26)%增加到(40.56±0.90)%。各藥物處理組間以及與空白對照組之間比較差異有統(tǒng)計學意義(P=0.00)。說明DAC、AS2O3單藥能夠誘導HL-60細胞凋亡，并呈時間-劑量依賴性。(圖5，表5,表6)
　　2.2 DAC聯(lián)合 AS2O3對 HL-60細胞作用24h、48h、72h后，凋亡率由(18.00±1.37)%增加到(57.76±0.61)%，各聯(lián)合組

13、與單藥組比較凋亡率顯著增加，且差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.00)。說明 DAC聯(lián)合AS2O3對 HL-60細胞誘導凋亡具有協(xié)同作用。(圖5,表7)
　　2.3經(jīng) DAC(50μmol/L)預(yù)處理后，不同濃度的AS2O3對 HL-60細胞作用24h、48h、72h后，凋亡率隨藥物濃度的增加和作用時間的延長而增加，凋亡率由(17.93±0.55)%增加到(60.96±0.70)%，較 AS2O3單藥組凋亡率明顯增加。各AS2O3濃度經(jīng)

14、DAC預(yù)處理后與AS2O3單藥組比較差異有統(tǒng)計學意義(P=0.00)。說明DAC預(yù)處理可以增強AS2O3對HL-60細胞誘導凋亡的作用。(圖5，表8)
　　3 DAC、AS2O3對HL-60細胞內(nèi)端粒酶hTERT mRNA表達水平變化的影響
　　3.1不同濃度DAC、AS2O3單藥對HL-60細胞作用48h后，增加藥物濃度，端粒酶hTERT mRNA表達水平有下降。單藥DAC(0μmol/L、1μmol/L、10μmol/L

15、、50μmol/L)，對hTERT mRNA的表達量由0.993±0.007下降到0.578±0.004；單藥 AS2O3（0μmol/L、1.25μmol/L、2.5μmol/L、5μmol/L)對hTERT mRNA的表達量由0.993±0.007下降到0.657±0.034。各處理組間hTERT mRNA比較，差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.00)。說明DAC、AS2O3單藥能夠降低HL-60細胞內(nèi)端粒酶hTERT mRNA基因的表達

16、水平，呈劑量依賴性。(圖6，表9，表10)
　　3.2不同濃度的DAC聯(lián)合AS2O3對HL-60細胞作用48h后，增加聯(lián)合組藥物濃度，對hTERT mRNA的表達量由0.528±0.022下降到0.213±0.023。各處理組之間hTERT mRNA表達水平差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.00)。說明DAC聯(lián)合AS2O3能夠增加HL-60細胞內(nèi)端粒酶hTERT mRNA的表達水平，且兩者具有協(xié)同作用。(圖6，表11)
　　3.3

17、經(jīng)DAC(50μmol/L)預(yù)處理后，不同藥物濃度的AS2O3對HL-60細胞作用48h后，增加藥物濃度，hTERT mRNA的表達量由0.161±0.022下降到0.065±0.008，較AS2O3單藥組比較表達水平顯著下降，hTERT mRNA各處理組間及與單藥 AS2O3比較 hTERT mRNA差異均具有統(tǒng)計學意義(P=0.00)。說明DAC預(yù)處理可以增加AS2O3對HL-60細胞內(nèi)端粒酶hTERT mRNA的抑制作用。(圖6，

18、表12)
　　4 DAC、AS2O3對HL-60細胞端粒酶內(nèi)hTERT蛋白表達水平變化的影響
　　4.1不同濃度DAC、AS2O3單藥對HL-60細胞作用48h后，隨著藥物濃度的增加，端粒酶hTERT的蛋白表達水平有下降。單藥 DAC（0μmol/L、1μmol/L、10μmol/L、50μmol/L）對hTERT的蛋白相對表達量由1.046±0.073下降到0.576±0.063；單藥 AS2O3（0μmol/L、1.25

19、μmol/L、2.5μmol/L、5μmol/L）對hTERT的蛋白相對表達量由1.046±0.073下降到0.426±0.014。各處理組間及處理組與空白對照組之間比較差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.00)。說明 DAC、AS2O3單藥能夠降低 HL-60細胞內(nèi)端粒酶 hTERT蛋白的表達，并呈劑量依賴性。(圖7，表13，表14)
　　4.2不同濃度的DAC聯(lián)合AS2O3對HL-60細胞作用48h后，隨著藥物濃度的增加，對 hTER

20、T的蛋白相對表達量由0.674±0.016下降到0.111±0.015，且差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.00)。說明 DAC聯(lián)合 AS2O3能夠抑制HL-60細胞端粒酶hTERT蛋白的表達，且兩者具有協(xié)同作用。(圖8，表15)
　　4.3經(jīng)DAC(50μmol/L)預(yù)處理后，不同藥物濃度的AS2O3對HL-60細胞作用48h后，增加藥物濃度，端粒酶的hTERT的蛋白相對表達量由0.311±0.015下降到0.055±0.011，較A

21、S2O3單藥組蛋白相對表達量顯著下降，各藥物處理組間及各處理組與AS2O3單藥組間比較差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.00)。說明DAC預(yù)處理可以提升AS2O3對HL-60細胞端粒酶hTERT蛋白的抑制作用。(圖9，表16)
　　結(jié)論：
　　1不同濃度地西他濱和三氧化二砷及兩藥聯(lián)合作用HL-60細胞株后，均有抑制增殖、誘導凋亡的作用，并呈劑量-時間依賴性。
　　2地西他濱和三氧化二砷發(fā)揮作用具有協(xié)同效應(yīng)。
　　3經(jīng)地