三氧化二砷對(duì)人胃癌細(xì)胞端粒酶活性的影響及端粒酶在人胃癌基因治療中的應(yīng)用.pdf

1、胃癌在中國(guó)各種惡性腫瘤中占首位,每年死于胃癌的患者約16萬(wàn).因此,針對(duì)胃癌治療的研究成為臨床和基礎(chǔ)研究工作的重點(diǎn),特別是隨著人類基因組計(jì)劃的完成,基因治療將成為二十一世紀(jì)腫瘤治療的重點(diǎn)策略.端粒酶是一種特殊的核糖核蛋白聚合酶,它能以自身的RNA作為模板合成端粒,彌補(bǔ)端粒丟失,對(duì)維持端粒長(zhǎng)度,使細(xì)胞獲得永生化起重要作用.端粒酶是迄今發(fā)現(xiàn)的一個(gè)最為廣譜和特異的腫瘤標(biāo)志物,與細(xì)胞衰老、永生化和腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)系.端粒酶之所以能成為腫瘤

2、治療的新靶點(diǎn),在于大多數(shù)正常組織中沒(méi)有活性或活性極低,而85﹪以上的惡性腫瘤具有很高的端粒酶活性.人的端粒酶復(fù)合物由多種成份組成,但是端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)卻是控制端粒酶活性的關(guān)鍵組分.在細(xì)胞永生和腫瘤進(jìn)展過(guò)程中端粒酶的激活需要誘導(dǎo)hTERT的表達(dá).最近的研究報(bào)道,hTERT基因與端粒酶活性具有密切的相關(guān)性.因此,利用hTERT基因作為腫瘤治療的靶點(diǎn),將

3、使基因治療更具有明確的靶向性.基于此思路,我們首先研究了三氧化二砷對(duì)人胃癌細(xì)胞端粒酶活性的影響及可能的作用機(jī)制,為三氧化二砷作為端粒酶抑制劑用于胃癌的治療提供新的理論依據(jù).其次,我們探討了端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因在人胃癌細(xì)胞基因治療中的作用.論文一 三氧化二砷對(duì)人胃癌BGC-823細(xì)胞端粒酶的影響;目的:研究三氧化二砷對(duì)人胃癌BGC-823細(xì)胞端粒酶的影響及可能的作用機(jī)制.方法:以不同濃度的三氧化二砷作用于人胃癌BGC-823細(xì)胞,通過(guò)MTT

4、法測(cè)定細(xì)胞活力;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期變化及凋亡;TRAP PCR ELISA方法檢測(cè)細(xì)胞端粒酶活性的變化;RT-PCR半定量方法檢測(cè)細(xì)胞端粒酶hTERT基因mRNA的轉(zhuǎn)錄水平.三氧化二砷對(duì)人胃癌BGC-823細(xì)胞的抑制作用可能是通過(guò)二條途徑實(shí)現(xiàn)：一是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，另一個(gè)是通過(guò)下調(diào)hTERT基因mRNA的轉(zhuǎn)錄來(lái)下調(diào)細(xì)胞的端粒酶活性.論文二 端粒酶反義hTERT基因逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建;目的：構(gòu)建反義人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（hTERT)基因真核

5、表達(dá)載體.方法：一步法從人慢性髓原白血病細(xì)胞株K562細(xì)胞中提取總RNA，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）擴(kuò)增出人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因起始密碼子至下游長(zhǎng)156個(gè)堿基的DNA片斷，反向連入逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLNCX的限制性內(nèi)切酶Hind Ⅲ和Cla Ⅰ酶切位點(diǎn)上，即構(gòu)建成hTERT的反義表達(dá)載體，并經(jīng)酶切鑒定和測(cè)序確認(rèn).結(jié)論：成功構(gòu)建了人端粒酶hTERT基因反義表達(dá)載體，為進(jìn)一步研究反義hTERT基因轉(zhuǎn)染對(duì)胃癌細(xì)胞端粒酶及生物學(xué)行為的

6、影響奠定了基礎(chǔ).論文三 端粒酶反義hTERT基因轉(zhuǎn)染對(duì)人胃癌細(xì)胞系的影響;目的：將構(gòu)建成功的人端粒酶反義hTERT基因逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染人未分化胃癌細(xì)胞系HGC-27，并觀察其對(duì)人胃癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響，探討反義hTERT基因治療的可行性.結(jié)論：外源端粒酶反義hTERT基因通過(guò)封閉hTERT基因的mRNA，抑制其表達(dá)，從而抑制胃癌細(xì)胞端粒酶活性，進(jìn)一步顯著抑制HGC-27細(xì)胞的生長(zhǎng)并促進(jìn)其凋亡.端粒酶反義hTERT基因，可能應(yīng)用于胃癌