miR-137靶向TNFAIP1調節(jié)Aβ誘導的神經毒性致病機制研究.pdf

1、背景：
　　阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是一種常見的老年中樞神經系統疾病，主要引起患者神經紊亂、記憶力減退、行為和社交功能異常及認知能力減弱，病程呈慢性進行時，隨著病程的延長，病情逐漸加重，直至完全喪失獨立生活能力。AD特征性病理變化表現為細胞外老年斑，神經細胞內神經元纖維纏結，以及神經元丟失伴膠質細胞增生等。盡管AD發(fā)病機制還未有明確報道，但大量研究表明β-淀粉樣(Aβ)蛋白沉積誘導的神經炎癥及細

2、胞凋亡在AD的發(fā)生發(fā)展過程中起著十分重要的作用。
　　microRNA（簡稱miRNA）是一種內生且高度進化的非編碼小RNA，長度約為20-24個核苷酸。miRNA通過與靶mRNA3'端非編碼區(qū)(UTR)發(fā)生互補配對使mRNA降解或翻譯過程受到抑制，miRNA137位于人染色體1p22位置，在中樞神經系統尤其是海馬齒狀回及分子層中含量豐富，影響大腦可塑性及新生神經元的產生。miRNA在許多疾病中發(fā)揮著重要作用，尤其是在腫瘤及神經系

3、統疾病中意義重大，它可以通過調控神經元的成熟誘導精神分裂癥的發(fā)生，同時與AD患者發(fā)病關系極為密切。腫瘤壞死因子相互作用蛋白(TNFAIP1)是第一個被鑒定的臍帶血管內皮細胞中能受TNF-α和IL-6誘導的蛋白，屬于PDIP1家族，含有N端BTB/POZ和C端PCNA結構域。TNFAIP1蛋白可分布在細胞質和細胞核中，在不同的組織中的表達存在差異性，是維持正常細胞生長必須的。TNFAIP1蛋白結構具有高度保守性，主要參與DNA的復制，DN

4、A修復和細胞凋亡等過程，在AD發(fā)生發(fā)展中起著十分重要的作用，但目前缺乏有力證據米闡述miR-137及TNFAIP1在AD發(fā)生中的致病機制。
　　目的：
　　本課題研究Aβ對miR-137及TNFAIP1表達水平的影響，并對miR-137的靶基因進行預測及驗證，同時分析miR-137過表達對Aβ誘導的神經毒性的影響以及miR-137靶向結合TNFAR1抑制Aβ誘導的神經毒性作用機制。旨在了解miR-137在Aβ誘導的神經毒性作

5、用機制，進而為AD臨床診斷以及靶向治療提供可靠依據。
　　方法：
　　(1)設計并合成miR-137、TNFAIP1、U6、GAPDH特異性引物，將不同濃度的Aβ25-35(0，5，10，20μM)加入皮質神經元細胞及N2a細胞中培養(yǎng)構建Aβ體外培養(yǎng)模型，采用qRT-PCR方法對Aβ25-35作用下細胞中miR-137及TNFAIP1mRNA表達水平進行分析，采用Westernblot法對TNFAIP1蛋白表達水平進行分析。

6、
　　(2)利用生物信息學軟件分析miR-137的靶基因，構建了pmirGLO-TNFAIP1-3'UTR-WT和pmirGLO-TNFAIP1-3'UTR-MUT重組質粒，并將重組質粒及miR-137共轉染到239TN細胞中，采用熒光素酶雙報告基因法檢測細胞中熒光素酶活性;采用qRT-PCR方法對miR-137轉染組、anti-miR-137轉染組、miR controls轉染組、anti-miR controls轉染組皮質神經

7、元及N2a細胞中TNFAIP1mRNA表達水平進行分析;采用Westernblot法對不同組細胞中TNFAIP1蛋白表達水平進行分析。
　　(3)將miR-control及miR-137轉染N2a細胞，采用qRT-PCR測定細胞中miR-137表達水平。隨后分別在miR-control及miR-137轉染組中加入不同濃度的Aβ25-35，培養(yǎng)24h后，分別采用MTT法、流式細胞術、Caspase比色法及ELISA法測定不同轉染組及

8、不同Aβ25-35濃度作用下細胞活性，細胞凋亡率，Caspase活性及NF-□B活性的變化;采用Westernblot法對NF-□B蛋白表達水平進行分析。
　　(4)分別將si-control及si-TNFAIP1轉染N2a細胞，采用Westernblot測定細胞中TNFAIP1蛋白水平的相對表達量。隨后將實驗分為陰性對照組(NC組)及si-control、si-TNFAIP1、miR-control、miR-137、miR-13

9、7+pcDNA3.1、miR-137+pcDNA-TNFAIP1轉染N2a細胞組，NC細細胞中加入PBS緩沖液，其他各組分別加入20μM的Aβ25-35，培養(yǎng)24h后，采用分別采用MTT法、流式細胞術、Caspase比色法及ELISA法測定不同轉染組細胞活性，細胞凋亡率，Caspase活性及NF-□B活性的變化。
　　結果：
　　(1)qRT-PCR檢測結果顯示，隨著Aβ25-35濃度的增加，皮質神經元及N2a細胞中miR-

10、137相對表達水平與未加入Aβ25-35組相比顯著降低(P＜0.05);TNFAIP1mRNA和蛋白表達水平與未加入Aβ25-35組相比顯著增加(P＜0.05)。
　　(2)生物信息學軟件預測結果表明，TNFAIP1是miR-137的一個靶基因。熒光素酶檢測結果顯示，與對照組相比，miR-137與TNFAIP1-3'UTR-WT共轉染組的熒光素酶表達量明顯降低(P＜0.05);而miR-137與TNFAIP1-3'UTR-Mut共

11、轉染組細胞中的熒光素酶表達量則與對照組相比無顯著差異(P＞0.05)。qRT-PCR檢測結果顯示，與對照組相比，miR-137轉染組細胞中miR-137相對表達量顯著升高(P＜0.05);anti-miR-137轉染組細胞中miR-137相對表達量顯著降低(P＜0.05)。qRT-PCR和Westernblot檢測結果顯示，皮質神經元和N2a細胞中miR-137轉染組TNFAIP1mRNA和蛋白水平相對表達量與miR-control組相

12、比顯著降低（P＜0.05），anti-miR-137轉染組TNFAIP1mRNA和蛋白水平相對表達量較anti-miR-control組顯著增加(P＜0.05)。
　　(3)MTT法檢測結果顯示，隨著Aβ25-35濃度的增加，兩組細胞活性均逐漸降低，但Aβ25-35濃度為10μM及20μM時，miR-137轉染組與miR-control轉染組相比細胞活性明顯較高（P＜0.05）。流式細胞術和Caspase-3比色法檢測細胞凋亡情況

13、結果顯示，隨著Aβ25-35濃度的增加，miR-137組及miR-control組細胞凋亡率及Caspase-3活性逐漸升高，但與對照組相比，miR-137組細胞凋亡率及Caspase-3活性較低(P＜0.05)。ELISA測定NF-□B活性結果顯示，隨著Aβ25-35濃度的增加，miR-137組及miR-control組NF-□B活性逐漸升高，但與對照組相比，miR-137組NF-□B活性較低(P＜0.05)。
　　(4)Wes

14、ternblot法檢測結果顯示，si-TNFAIP1轉染組細胞中TNFAIP1蛋白相對表達量明顯下降;pcDNA-TNFAIP1轉染組N2a細胞中TNFAIP1蛋白相對表達量明顯升高。MTT法檢測結果顯示，Aβ25-35作用后細胞活性明顯降低，si-TNFAIP1組與miR-137過表達組能夠逆轉Aβ25-35對細胞活性的抑制(P＜0.05)，miR-137+pcDNA-TNFAIP1組細胞活性與miR-137+pcDNA3.1組相比明

15、顯較低（P＜0.05）。流式細胞術及Caspase-3比色法檢測細胞凋亡情況結果顯示，si-TNFAIP1組及miR-137過表達組能明顯逆轉Aβ25-35對細胞凋亡的促進作用（P＜0.05）;miR-137+pcDNA-TNFAIP1組細胞中胞凋亡率及Caspase-3活性與miR-137+pcDNA3.1細相比較高（P＜0.05）。ELISA測定NF-□B活性結果顯示，Aβ25-35可使NF-□B活性增強，si-TNFAIP1組及m

16、iR-137過表達組能明顯逆轉Aβ25-35對NF-□B活性的促進作用(P＜0.05)，而TNFAIP1過表達可明顯解除si-TNFAIP1及miR-137對NF-□B活性的抑制作用（P＜0.05）。
　　結論：
　　Aβ25-35能夠抑制細胞中miRNA的表達，促進TNFAIP1的表達。TNFAIP1是miR-137的一個靶基因，miR-137過表達通過靶向結合TNFAIP1激活NF-□B通路進而抑制Aβ25-35誘導的細