miR-124和miR-137在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的抑癌作用及其機(jī)制研究.pdf

1、研究背景：
　　膠質(zhì)瘤，又稱神經(jīng)膠質(zhì)瘤，發(fā)病率高，治療困難，其中惡性膠質(zhì)瘤和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤是神經(jīng)系統(tǒng)最常見的原發(fā)腦腫瘤，惡性程度極高，患者預(yù)后差，是僅次于胰腺癌和肺癌的對(duì)人類健康造成巨大影響的惡性疾病。目前膠質(zhì)瘤的發(fā)病原因尚不清楚，遺傳因素、病毒感染、頭部外傷、放射照射、免疫抑制劑、內(nèi)分泌和代謝紊亂等均可增加其發(fā)病率。關(guān)于膠質(zhì)瘤的分子遺傳學(xué)研究證實(shí)，7號(hào)染色體出現(xiàn)原癌基因增多和10號(hào)染色體出現(xiàn)抑癌基因缺失以及一些基因如EGFR、c-

2、erbB1、H-ras、gli、N-myc等基因的異常擴(kuò)增或表達(dá)，以及一些抑癌基因的丟失或者表達(dá)下調(diào)等，都是膠質(zhì)瘤潛在的高危因素。miRNA是一類長18-25個(gè)核苷酸的非編碼RNA小分子，通過靶向沉默靶基因發(fā)揮轉(zhuǎn)錄后調(diào)控功能。miRNA在機(jī)體幾乎無處不在，具有廣泛的生物學(xué)功能，尤其是在腫瘤發(fā)生發(fā)展以及腫瘤耐藥中miRNA是機(jī)體不可或缺的調(diào)控分子，其調(diào)控機(jī)制和具體作用方式也是復(fù)雜的。依據(jù)miRNA在腫瘤中的作用可簡單的劃分為抑癌miRNA

3、和癌miRNA，而miR-124和miR-137均屬于抑癌miRNA。雖然通過生物信息分析和一些實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)其抑癌功能，但是具體作用機(jī)制尚不清楚。本文擬尋找miR-124和miR-137新的作用靶點(diǎn)，豐富其抑癌作用機(jī)制，同時(shí)為增強(qiáng)膠質(zhì)瘤化療耐藥敏感性提供新的候選策略。
　　第一部分：miR-124在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GBM）細(xì)胞中的抑癌作用及機(jī)制研究
　　目的：闡明miR-124在GBM細(xì)胞中的抑癌機(jī)制及其在TMZ化療耐藥中的作

4、用。方法：首先在GBM細(xì)胞中瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miR-124 mimics過表達(dá)miR-124然后給TMZ，檢測(cè)了細(xì)胞的凋亡情況。隨后構(gòu)建了RAD51-3'UTR表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行miR-124與RAD51的雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)。通過qRT-PCR和Western blot檢測(cè)miR-124過表達(dá)后RAD51在mRNA和蛋白水平的變化。瞬轉(zhuǎn)miR-124 mimics后給予TMZ處理，通過對(duì)γH2AX和RAD51的間接免疫熒光染色，進(jìn)一步驗(yàn)證miR-

5、124與RAD51的靶標(biāo)關(guān)系。最后通過RAD51干涉驗(yàn)證RAD51在TMZ治療中的作用，并下載GEO數(shù)據(jù)分析RAD51表達(dá)量與GBM患者總體生存時(shí)間之間的關(guān)系。
　　結(jié)果：Annexin V/PI檢測(cè)證實(shí)過表達(dá)miR-124能促進(jìn)GBM細(xì)胞對(duì)TMZ的化療敏感性。DLR、qRT-PCR、Western blot以及間接免疫熒光染色等一系列實(shí)驗(yàn)證實(shí)RAD51是miR-124的直接靶基因。凋亡結(jié)果顯示干涉RAD51同過表達(dá)miR-124

6、具有相似的生物學(xué)效應(yīng)，均能夠增強(qiáng)GBM細(xì)胞對(duì)TMZ化療的敏感性。GEO數(shù)據(jù)生存分析證實(shí)RAD51表達(dá)量與GBM患者預(yù)后生存時(shí)間密切相關(guān)，RAD51表達(dá)量低的患者生存時(shí)間較長。
　　結(jié)論：miR-124直接靶向沉默RAD51，提高了GBM細(xì)胞對(duì)TMZ的化療敏感性，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。
　　第二部分：miR-137在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GBM）細(xì)胞中的抑癌作用及機(jī)制研究
　　目的：闡明miR-137在GBM細(xì)胞中的抑癌機(jī)制及其在TRA

7、IL治療中的增敏作用。
　　方法：首先在GBM細(xì)胞中瞬轉(zhuǎn)miR-137 mimics過表達(dá)miR-137然后給TRAIL，檢測(cè)了細(xì)胞的凋亡情況。隨后通過qRT-PCR和Western blot檢測(cè)從6個(gè)miR-137潛在的靶分子中篩選出了XIAP基因，其在mRNA和蛋白水平均顯著下調(diào)。進(jìn)一步構(gòu)建了XIAP-3'UTR表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行 miR-137與 XIAP的雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)。通過qRT-PCR檢測(cè)了15例臨床GBM標(biāo)本中mi

8、R-137與XIAP表達(dá)水平的相關(guān)性。構(gòu)建miR-137穩(wěn)定表達(dá)的慢病毒細(xì)胞株，并檢測(cè)其功能。在miR-137穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株中恢復(fù)XIAP表達(dá)檢測(cè)凋亡比率。最后建立裸鼠皮下荷瘤模型驗(yàn)證miR-137是否通過沉默XIAP增強(qiáng)TRAIL對(duì)GBM的治療效果。
　　結(jié)果：過表達(dá)miR-137后能促進(jìn)TRAIL對(duì)GBM細(xì)胞的殺傷作用，細(xì)胞凋亡率明顯增加。qRT-PCR和Western blot檢測(cè)證實(shí)過表達(dá)miR-137后XIAP在mRNA和蛋

9、白水平均顯著下調(diào)。DLR實(shí)驗(yàn)證實(shí)了miR-137直接結(jié)合于XIAP的3'UTR。15例臨床標(biāo)本中 miR-137和XIAP基因表達(dá)量的Pearson's相關(guān)性分析顯示二者呈負(fù)相關(guān)。miR-137穩(wěn)定表達(dá)的慢病毒細(xì)胞株構(gòu)建成功，“恢復(fù)”實(shí)驗(yàn)證實(shí)過表達(dá)miR-137的細(xì)胞株中再次過表達(dá)XIAP后，miR-137對(duì)TRAIL增敏的作用發(fā)生逆轉(zhuǎn)。體外裸鼠荷瘤實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miR-137通過直接靶向XIAP基因增強(qiáng)TRAIL敏感性，抑制裸鼠皮下腫瘤生長