三個(gè)動(dòng)物源性鏈球菌新種的發(fā)現(xiàn)、基因組及毒力基因分析.pdf

1、本課題圍繞“動(dòng)物源病原體的發(fā)現(xiàn)及其對(duì)人類(lèi)致病性”這一科學(xué)問(wèn)題，以我國(guó)青藏高原喜馬拉雅旱獺呼吸道攜帶的病原體譜系為研究目標(biāo)，將現(xiàn)場(chǎng)流行病學(xué)調(diào)查與實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)分析相結(jié)合，采用PacBio高通量測(cè)序技術(shù)、微生物培養(yǎng)組學(xué)技術(shù)和未知新病原鑒定技術(shù)相結(jié)合，對(duì)喜馬拉雅旱獺呼吸道菌群開(kāi)展研究，分離獲得三個(gè)鏈球菌新種，分別命名為旱獺鏈球菌(Streptcoccus marmotae sp.nov.)，喜馬拉雅鏈球菌(Streptcoccus himalay

2、ana sp.nov.)和耐鹽鏈球菌(Streptcoccus halotolerans sp.nov.)。通過(guò)研究初步了解了喜馬拉雅旱獺呼吸道菌群分布特征;明確了三個(gè)鏈球菌新種的準(zhǔn)確分類(lèi)地位以及與近源種的生物系統(tǒng)學(xué)關(guān)系;并對(duì)其全基因組特征、毒力相關(guān)因子開(kāi)展了比較基因組學(xué)的分析。
　　本課題對(duì)喜馬拉雅旱獺呼吸道樣本采用擴(kuò)增16S rRNA序列，然后克隆轉(zhuǎn)化，blast比對(duì)，對(duì)其呼吸道菌群展開(kāi)分析。結(jié)果表明:鏈球菌屬是喜馬拉雅旱獺呼

3、吸道的主要菌群，占菌群結(jié)構(gòu)的49.8％;其次為埃希菌屬和韋榮菌屬，分別占菌群結(jié)構(gòu)的11.1％和8.5％;此外，在所有未知新種的克隆中，疑似鏈球菌屬新種的克隆數(shù)占69.1％，提示喜馬拉雅旱獺呼吸道菌群中分布大量未知鏈球菌新種，為進(jìn)一步分離培養(yǎng)提供了理論依據(jù)。以此為線(xiàn)索，我們應(yīng)用微生物培養(yǎng)組學(xué)方法對(duì)75份喜馬拉雅旱獺氣管黏膜標(biāo)本進(jìn)行篩查，成功分離到三個(gè)疑似鏈球菌新種。經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察、生化反應(yīng)比較，并結(jié)合分子生物學(xué)鑒定，該三個(gè)未知新種均歸屬為鏈

4、球菌屬，根據(jù)三個(gè)未知新種的特征，依照國(guó)際微生物命名標(biāo)準(zhǔn)，分別將其命名為旱獺鏈球菌(S.marmotae sp.nov.)，喜馬拉雅鏈球菌(S.himalayana sp.nov.)和耐鹽鏈球菌(S.halotolerans sp.nov.)。
　　三個(gè)鏈球菌新種在血平板上37℃培養(yǎng)24h后形成直徑0.5-1.0mm，灰白色、圓形隆起、濕潤(rùn)、邊緣整齊的針尖狀菌落，a溶血。單個(gè)菌體呈圓形或橢圓形，數(shù)個(gè)菌體排列呈鏈狀，革蘭染色陽(yáng)性，無(wú)芽

5、胞，無(wú)鞭毛。三個(gè)鏈球菌新種均在22、30、37、42℃培養(yǎng)時(shí)生長(zhǎng)，4℃、15℃時(shí)不生長(zhǎng)。其中喜馬拉雅鏈球菌和旱獺鏈球菌在含2.5％NaCl的腦心羊血培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，在含4.5％、6.5％NaCl的腦心羊血培養(yǎng)基上不生長(zhǎng)。但是耐鹽鏈球菌在含9.0％NaCl的腦心羊血培養(yǎng)基上仍可以生長(zhǎng)。三個(gè)鏈球菌新種的生化反應(yīng)結(jié)果明顯區(qū)別于同屬內(nèi)其他近源種。
　　基于16S rRNA序列、3個(gè)保守基因（sodA、rpoB和groEL）和全基因組的系統(tǒng)發(fā)

6、生關(guān)系分析表明，旱獺鏈球菌與S.suis，S.ovis和S.minor親緣關(guān)系較近，歸屬為鏈球菌屬豬鏈群;喜馬拉雅鏈球菌與S.acidominimus，S.cuniculi和S.marmotae有較近的進(jìn)化關(guān)系，也屬于鏈球菌屬豬鏈群;耐鹽鏈球菌與變異群的S.thoraltensis，S.hyovaginalis聚在一起，歸屬為鏈球菌屬變異群。通過(guò)與GenBank中其他鏈球菌已知種進(jìn)行DNA-DNA在線(xiàn)雜交，發(fā)現(xiàn)三個(gè)鏈球菌新種與其他鏈球菌

7、已知種相似性均低于70％。
　　旱獺鏈球菌基因組全長(zhǎng)2，322，791bp，G+C含量為41.6mol％，編碼2，377個(gè)基因，攜帶58個(gè)tRNAs，12個(gè)rRNAs，2個(gè)質(zhì)粒(大小分別為3，762bp和5，997bp)，11個(gè)基因組島。喜馬拉雅鏈球菌基因組全長(zhǎng)2，275，471bp，G+C含量為41.3mol％，編碼2，195個(gè)基因，攜帶57個(gè)tRNAs，12個(gè)rRNAs，6個(gè)基因組島。耐鹽鏈球菌基因組全長(zhǎng)1，823，556bp

8、，G+C含量為39.9mol％，編碼2，068個(gè)基因，攜帶68個(gè)tRNAs，18個(gè)rRNAs，9個(gè)基因組島。
　　通過(guò)將三種鏈球菌新種的基因組序列與VFDB數(shù)據(jù)庫(kù)收錄的毒力基因進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，結(jié)果表明Has(Hyaluronic acid capsule)，ClpC(Caseinolytic protease C)和ClpE(Caseinolytic protease E)是三個(gè)鏈球菌新種共有的毒力因子;作為肺炎鏈球菌主要