篩選受轉(zhuǎn)化調(diào)控的肺炎鏈球菌毒力基因.pdf

1、肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae，S.pn)是一種常見的革蘭陽性條件致病菌，可引起肺炎、中耳炎、菌血癥、腦膜炎等嚴重疾病。在全球有很高的發(fā)病率和死亡率。老人、兒童以及艾滋病和先天免疫缺陷的患者是嚴重S.pn感染的高危人群。由于S.pn抗生素耐藥率的增加和目前疫苗的缺陷性，使得其感染的后果非常嚴重。因此要想從根本上解決S.pn的防治問題，就要深入了解其致病的分子機制，為研發(fā)新的藥物和疫苗提供理論和實驗依據(jù)。

2、 轉(zhuǎn)化是細菌之間基因轉(zhuǎn)移的一種方式，有現(xiàn)象提示肺炎鏈球菌的轉(zhuǎn)化可能與細菌的毒力、耐藥相關(guān)。本研究利用差異熒光誘導技術(shù)(differential fluorescence induction，DFI)，在體內(nèi)大規(guī)模地篩選鑒定肺炎鏈球菌受轉(zhuǎn)化調(diào)控的毒力基因，這些基因很可能是肺炎鏈球菌條件致病過程中的重要基因。研究內(nèi)容包括以下三個部分。 1.肺炎鏈球菌啟動子誘捕文庫的構(gòu)建與初步分析。用DFI篩選病原菌體內(nèi)誘導的基因，首先要構(gòu)建一個

3、包含無啟動子序列的報告基因的啟動子誘捕文庫。以本課題組已構(gòu)建的自殺質(zhì)粒pEVP3-SDGFP為骨架，將Sau3A I酶切的肺炎鏈球菌基因組DNA隨機片段(200～800bp)克隆到此載體gfp基因上游的BglⅡ位點，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，獲得了約47000個重組子，提取質(zhì)粒，即為含有肺炎鏈球菌基因組DNA隨機酶切片段的質(zhì)粒庫。考慮到DNA片段的插入方向和大小(200～800bp，平均500bp)，該質(zhì)粒庫大約覆蓋肺炎鏈球菌基因

4、組全長(2.2Mb)的5倍，插入率達到90％以上，且有較強的隨機性，質(zhì)量較高。將該質(zhì)粒庫轉(zhuǎn)化入S.pn TIGR4菌株，獲得包含約500 000個S.pn轉(zhuǎn)化子的菌株庫。經(jīng)過體內(nèi)和體外實驗表明，其包含插入了S.pn條件表達基因片段的細菌，可以報告在特定條件下的基因表達，并且可通過流式細胞儀識別、分選。該文庫的成功構(gòu)建為進一步利用差異熒光誘導技術(shù)篩選S.pn體內(nèi)誘導基因奠定了良好的基礎(chǔ)。 2.DFI篩選小鼠體內(nèi)誘導表達的S.pn基

5、因及生物信息學分析。將構(gòu)建好的S.pn菌株庫腹腔注射感染BALB/c小鼠，24h后取小鼠心臟血和肺組織，分離出細菌，利用熒光激活細胞分選技術(shù)(fluorescence-activated cell sorting，F(xiàn)ACS)分選收集有熒光的細菌，最后共挑取64個菌落進行生物信息學分析。首先我們應(yīng)用酶切自連法，即提取這些菌株的染色體DNA，用BamH Ⅰ酶切，并自身環(huán)化，使整合到染色體上的重組自殺質(zhì)粒脫落下來并重新環(huán)化。然后對插入的隨機片

6、段進行測序后進行生物信息學分析，共證實有10個不同的基因片段，其中8個從血液中篩出，2個從肺組織中篩出。對這10個體內(nèi)誘導基因片段進行開放讀碼框(ORF)的搜索，總共發(fā)現(xiàn)18個ORFs，7個為單獨的ORF，3個為含有多個ORFs的操縱子結(jié)構(gòu)，這些基因包括參與能量(糖)轉(zhuǎn)運和代謝、物質(zhì)運輸、細胞壁合成、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、編碼表面錨定蛋白以及功能未知基因。這些基因可能S.pn致病相關(guān)，可用于下一步研究其是否受轉(zhuǎn)化調(diào)控。 3.肺炎鏈球菌轉(zhuǎn)化缺

7、陷菌的構(gòu)建和分析。對含上述10個基因片段的S.pn菌株，分別構(gòu)建其轉(zhuǎn)化缺陷菌；將轉(zhuǎn)化缺陷前、后的S.pn菌株培養(yǎng)至對數(shù)生長期，腹腔注射感染BALB/c小鼠；24h后取小鼠心臟血和肺組織，分離出細菌，流式細胞儀分析S.pn菌株轉(zhuǎn)化缺陷前后熒光表達情況。共觀察到3株轉(zhuǎn)化缺陷后的細菌不表達熒光，因此其包含的3個基因片段是受轉(zhuǎn)化調(diào)控的，它們都是從血液中篩出，對照上部分生物信息學分析結(jié)果，這3個基因片段分別參與能量代謝、物質(zhì)運輸和未知功能基因，對