肺炎鏈球菌SWU02全基因組測(cè)定及其整合性接合元件分析.pdf

1、肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae，Spn）是呼吸道感染的主要病原菌之一，已可以引起腦膜炎、胸膜炎、敗血癥等。以青霉素為代表的β內(nèi)酰胺類藥物和以紅霉素為代表的大環(huán)內(nèi)酯類藥物，曾是抗肺炎鏈球菌感染的一線藥物，而兩類藥物的耐藥率不斷攀升，給臨床治療帶來了極大困難。本研究通過比較肺炎鏈球菌耐藥特征，分析高毒力菌株全基因組和整合性接合元件，研究其耐藥機(jī)制。
　　目的：調(diào)查2015年10月至2016年6月某醫(yī)院臨床

2、所分離62株肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae， Spn）的耐藥特征，為臨床正確使用抗生素提供依據(jù)；了解肺炎鏈球菌 SWU02全基因組基本特征，分析其耐藥基因；分析肺炎鏈球菌 SWU02全基因組的整合性接合元件(Integrative and Conjugative Element，ICE)的遺傳特征，研究其耐藥播散機(jī)制。
　　方法：（1）收集2015年10月至2016年6月某醫(yī)院臨床分離的62株肺炎鏈球

3、菌，用法國(guó)梅里埃VITEK-2 Compact全自動(dòng)微生物鑒定儀鑒定菌種，用E-test方法檢測(cè)其對(duì)14種臨床常用抗菌藥物的耐藥情況。（2）通過第三代高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)肺炎鏈球菌SWU02進(jìn)行全基因測(cè)序，原始測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接、組裝、基因預(yù)測(cè)、基因功能注釋、耐藥基因和毒力基因分析。用多點(diǎn)位序列分型技術(shù)（MLST）分析肺炎鏈球菌SWU02的ST型別，在NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫查找并下載肺炎鏈球菌常見血清型序列19A、19F、23F、6A

4、/B、14B/C、15B/C，通過 BLAST比對(duì)確定肺炎鏈球菌 SWU02血清型。（3）用隱馬爾科夫模型識(shí)別肺炎鏈球菌SWU02的整合性接合元件， NCBI數(shù)據(jù)庫和 ICEmerg數(shù)據(jù)庫檢索肺炎鏈球菌整合性接合元件（ICE）的參考序列，將肺炎鏈球菌SWU02整合性接合元件序列與其進(jìn)行比較。
　　結(jié)果：（1）62株肺炎鏈球菌對(duì)青霉素（PEN）和紅霉素（ERY）耐藥率為100％，對(duì)四環(huán)素（TE）、阿奇霉素（AZM）、阿莫西林（AMC

5、）、復(fù)方新諾明（SXT）耐藥率較高，分別為95.2%、75.8%、72.6%、71.0%。對(duì)左氧氟沙星（LEV）、莫西沙星（MXF）、利奈唑胺（LNZ）、萬古霉素（VAN）耐藥率較低，分別為12.9%、11.3%、6.4%、0.0%、0.0%。（2）測(cè)序結(jié)果表明，SWU02基因組含有2092148 bp個(gè)堿基，G+C堿基占39.77%。共挖掘出2120個(gè)各種編碼基因，2012個(gè)CDS（蛋白質(zhì)編碼區(qū)），93個(gè)假基因，13個(gè)rRNAs（包括

6、5S，16S，23S），58個(gè)tRNAs，6個(gè)ncRNA。主要耐藥基因包括對(duì)喹諾酮類抗生素耐藥基因 gyrA、gyrB，對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥基因 ermB、mefA、mreC、mreD，對(duì)四環(huán)素類抗生素耐藥基因tetA、tetC、tetM。另外含有12個(gè)經(jīng)典的肺炎鏈球菌毒力基因pspC、lytA、lytB、rrgA、nana、iga、ply、hysA stkP、clpP、cps2A、pcsB。序列提交到NCBI數(shù)據(jù)庫得到登錄號(hào)為CP0

7、18347，遺傳進(jìn)化分析，該菌株與登錄號(hào)為CP006844菌株遺傳距離最近。SWU02經(jīng)多點(diǎn)位序列分型和血清分型，確定型別為ST271,19F，該型別以多重耐藥和同時(shí)攜帶ermB和mef基因?yàn)橹饕攸c(diǎn)。（3）通過比較發(fā)現(xiàn)該菌株在ORF91到ORF115區(qū)域存在整合性接合元件（ICE）結(jié)構(gòu)，該ICE屬于Tn916家族，序列全長(zhǎng)25881bp，GC含量38.7%，含有25個(gè)ORF，所編碼蛋白依次為：DUF961、DUF961、FtsK、rs

8、tA1、ermB、Transposase、conjugal transfer protein、ArdA、membrane protein、ATP/GTP、conjugative transposon、NlpC/P60、conjugative transposon、tetM、umuC、ImsC、YolD、mel、hypothetical protein、Mef（A）、DNA recombinase hypothetical protein

9、、helix-turn-helix protein、DNA-binding protein、Xis、int。
　　結(jié)論：(1)所分離的肺炎鏈球菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物耐藥率為32.6-72.3%，大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物耐藥率為75.8-100%，四環(huán)素類抗生素耐藥率為95.2%，耐藥情況嚴(yán)峻。(2)全基因測(cè)序表明，肺炎鏈球菌 SWU02基因組全長(zhǎng)2092148 bp，G+C堿基占39.77%，含有ErmB、Tet(M)、Mef(E)等