clpp基因缺陷對肺炎鏈球菌毒力表達降低的研究

1、Comment[k1]:題目短語或句子成分不對clpP基因缺陷對肺炎鏈球菌毒力表達降低的研究基因缺陷對肺炎鏈球菌毒力表達降低的研究張群，胥文春，尹一兵，朱興華，李有強，張雪梅(重慶醫(yī)科大學醫(yī)學臨床檢驗診斷學省部共建教育部重點實驗室，重慶400016)摘要：目的目的探索clpP基因缺陷對肺炎鏈球菌(streptococcusStreptococcuspneumoniae，，S.pn)毒力的影響。方法方法用長臂同源多聚酶鏈式反應(LFHPC

2、R)方法失活clpP基因，用PCR、Westernblot鑒定缺陷菌株，通過RTPCR分析自溶素(majautolysinA，lytA)、表面黏附A(pneumococcalsurfaceadhesionA，psaA)、溶血素(pneumolysin，ply)和膽堿結(jié)合蛋白A(cholinebindingproteinAcbpA)的表達，并通過動物實驗觀察clpP基因缺陷株毒力改變情況。結(jié)果結(jié)果RTPCR顯示clpP缺陷株的4個毒力因子

3、mRNA表達水平均低于野生菌，兩者比較有統(tǒng)計學差異（P0.05）；小鼠毒力實驗表明野生菌株半數(shù)致死時間為22h，而缺陷株半數(shù)致死時間為8d，兩者比較有統(tǒng)計學差異（P0.0l）；缺陷菌在小鼠體內(nèi)被清除速度也顯著快于野生菌株（P0.05）。結(jié)論結(jié)論clpP基因缺陷使S.pn多種毒力因子表達減弱，毒力降低。關鍵詞關鍵詞：肺炎鏈球菌；毒力因子；熱休克蛋白；clpP基因中圖法分類號中圖法分類號：R378文獻標識碼文獻標識碼：AEffectofcl

4、pPgenedeletionattenuatestheonvirulenceofStreptococcuspneumoniaeZHANGQunXUWenchunYINYibingZHUXinghuaLIYouqiangZHANGXuemei(KeyLabatyofLabatyMedicalDiagnosticsMinistryofEducationChongqingMedicalUniversityChongqing400016Chin

5、a)KeyLabatyofLabatyMedicalDiagnosticsMinistryofEducationChongqingUniversityofMedicalScienceChongqing400016China）Abstract:ObjectiveToinvestigatetheeffectofclpPgenedeletiononthevirulenceofStreptococcuspneumoniae.Methodsclp

6、PdeficientstrainwasconstructedbyLFHPCRidentifiedbyPCRwesternWesternbloting.RelativequantitativeRTPCRwasusedtomeasurethemRNAexpressionlevelsofautolysinApneumococcalsurfaceadhesionApneumolysincholinebindingproteinA.studyth

7、evirulencechangebymicevirulenceexperiments.TheclpPdeficientstrainwasappliedtoinfectBALB／cmicetodeterminetheitsvirulence.ResultsclpPgenewasreplacedcompletelybyermcassette.TheexpressionofvirulentfactsinclpPdeficientstrainw

8、aslowerthanthatofthewidetype(P0.05)，.Micevirulenceexperimentsshowedthemedianlethaltimeofthewidetypewas22h，whilethatofclpPclpPdeficientmutantwas8d(P001).TheeliminationofclpPdeficientmutantinfrommicebloodwasfasterthanthato

9、fthewidetype.ConclusionThedeficiencyofclpPgenedecreasestheexpressionofvirulentgenesofStreptococcuspneumoniae，thusfinallyresultinginreductionofreducedthebacterialvirulence.Keywds:streptococcusStreptococcuspneumoniae；virul

10、encefact；ploymerasechainreactionheatshockprotein；clpPgene肺炎鏈球菌(streptococcusStreptococcuspneumoniae，S.pn)是一種常見的條件致病菌，可引起肺炎、中耳炎、菌血癥、腦膜炎等嚴重疾病。S.pn從鼻咽部入侵血液或腦膜經(jīng)歷了30～34℃或37℃的熱應激，溫度的改變誘導細菌熱休克蛋白（HSP）合成一過性增高[1]。HSP幫助細菌適應不利生長環(huán)境，使

11、其得以生存。ClpP是細菌中一類高度保守并廣泛存在的HSP，與其他Clp分子伴侶家族一起可形成Clp蛋白酶復合體，在復合體中ClpP具有蛋白酶的活性，可通過清除細胞異?；蝈e誤折疊的蛋白質(zhì)以調(diào)控某些功能蛋白的穩(wěn)定性和活性，基金項目：國家自然科學基金(30600267)SupptedbytheNationalNaturalScienceFoundationofChina(30600267)作者簡介：張群，女，四川省人，博士研究生，主要從事肺

12、炎球菌致病機制方面的研究。電話:(023)62007256，Email：zhangqun198166@通信作者：張雪梅，電話：（023）68485216，Email:apoe@收稿日期：2008－修回日期：2008從而影響細菌的多種生物學性質(zhì)，因此ClpP可能在肺炎鏈球菌的致病過程中發(fā)揮重要的作用。本研究將通過長臂同源多聚酶鏈式反應(longflankinghomologypolymerasechainreaction，LFHPCR)方

13、法數(shù)據(jù)以s表示，方差齊同時采用t檢驗，方差不齊時x采用F檢驗，小鼠毒力實驗結(jié)果采用Longrank檢驗，以SAS統(tǒng)計軟件進行分析。2結(jié)果結(jié)果2.1S.pnclpP基因缺陷菌株的獲取分別以TIGR4、CMP8的DNA為模板，用PCR擴增出了clpPUP(210bp)、clpPDW(449bp)和erm(780bp)3個片段（圖1）。LFHPCR連接3個片段：UPermDW(1339bp)，測序結(jié)果顯示3個片段連接正確(圖2)。利用同源重組

14、，將連接片斷轉(zhuǎn)化入TIGR4野生菌株，紅霉素血平板篩選出clpP缺陷菌株。780bp449bp210bpM：DNA標準（DL2000）；1：clpPUP；2：clpPDW；3：erm圖1PCRPCR擴增擴增clpPclpPUPUP、clpPDWclpPDW、ermerm的電泳結(jié)果的電泳結(jié)果1M2637451439bp355bp780bp990bp1229bpABA；M：DNA標準（DL2000）；1：TIGR4的erm基因（陰性對照）；

15、2：CPM8的erm基因（陽性對照）；3：△clpP的erm基因；4：△clpP的clpPUPerm；5：△clpP的clpPDW＋erm；6：TIGR4的clpP基因；7：△clpP的clpP基因BUPermDW；M：DNA標準(DL2000)圖3clpPclpP缺陷菌株的缺陷菌株的PCRPCR鑒定結(jié)果鑒定結(jié)果表2毒力基因表達量與相應毒力基因表達量與相應16S16SrRNArRNA表達量的比值表達量的比值(n=3(n=3，s)s)xS

16、.pnplypsaAlytAcbpATIGR40.850.030.730.070.710.050.690.01△clpP0.640.04a0.430.01a0.530.06a0.500.02aa：P＜0.05，與TIGR4比較1439bpM：DNA標準（DL2000）；1：UPermDW圖2LFHPCRLFHPCR連接連接3個片段的電泳結(jié)果個片段的電泳結(jié)果21KDa1：陰性對照；2：ClpP在△clpP中的表達；3：ClpP在TIGR4

17、中的表達圖4WesternWesternblotblot分析分析ClpPClpP在TIGR4TIGR4和△clpP△clpP中的表達中的表達表3S.pnS.pn在小鼠體內(nèi)清除時間情況在小鼠體內(nèi)清除時間情況[n=6[n=6，loglog（cfucfu／mlml），s]s]xS.pn12h24h36h48hTIGR46.230.425.180.465.020.924.340.67△clpP5.530.324.040.21a2.110.19a