自由能計(jì)算方法在耐藥性機(jī)制分析和遺傳病治療中的應(yīng)用.pdf

1、化學(xué)藥物在疾病的治療中起到了關(guān)鍵的作用，但部分化學(xué)藥物的重復(fù)使用會(huì)最終導(dǎo)致其藥效的下降甚至失活，主要原因是靶蛋白對(duì)藥物產(chǎn)生了抗性或耐受性。耐藥性經(jīng)常由靶蛋白的次級(jí)突變所引起，其宏觀現(xiàn)象通常表現(xiàn)為抑制劑與突變靶標(biāo)結(jié)合能力下降。如何正確理解耐藥性產(chǎn)生的分子機(jī)制，進(jìn)而為抗耐藥性藥物的發(fā)現(xiàn)和設(shè)計(jì)提供可靠依據(jù)已成為當(dāng)今藥物研發(fā)領(lǐng)域亟待解決的難題。通過(guò) X射線衍射和核磁共振技術(shù)可以得到蛋白質(zhì)?配體復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)，從而獲悉配體與靶點(diǎn)的相互作用模式。

2、但是當(dāng)有眾多藥物和眾多耐藥突變蛋白時(shí)，我們很難通過(guò)實(shí)驗(yàn)方法獲得突變體復(fù)合物的所有晶體結(jié)構(gòu)。隨著理論方法的發(fā)展和計(jì)算設(shè)備性能的不斷提升，分子模擬技術(shù)已成為耐藥性機(jī)制研究不可或缺的工具。本論文擬從自由能計(jì)算的角度揭示藥物耐藥性產(chǎn)生的分子機(jī)制，并對(duì)由“獲得功能性”（gain of function）和“喪失功能性”（loss of function）突變引起的遺傳病的治療提出化學(xué)藥物的治療策略。
　　由于目前自由能計(jì)算的方法眾多，精度不

3、同，而且在很大程度上存在體系特異性，因此在耐藥性機(jī)制研究之前，我們首先對(duì)應(yīng)用最為廣泛的兩點(diǎn)式自由能計(jì)算方法（MM/PB(GB)SA）做了整體的精度評(píng)估，并提出提高預(yù)測(cè)精度的計(jì)算策略。隨后，我們提出基于分子對(duì)接和 MM/PB(GB)SA重打分的計(jì)算策略，計(jì)算結(jié)果表明，MM/GBSA重打分可有效提高傳統(tǒng)分子對(duì)接的預(yù)測(cè)精度，此策略適用于沒(méi)有晶體結(jié)構(gòu)體系的耐藥性分析。
　　我們將MM/GBSA方法用于兩個(gè)體系（crizotinib-ALK

4、和crizotinib-ROS1）的耐藥性機(jī)制研究。對(duì)于ALK體系，MM/GBSA自由能計(jì)算表明，耐藥性突變L1152R和G1202R會(huì)嚴(yán)重影響體系構(gòu)象熵的變化，而且所研究的3個(gè)耐藥性突變（L1152R、G1202R、S1206Y）都會(huì)影響藥物?靶標(biāo)間氫鍵的變化。此外，我們還通過(guò)加強(qiáng)采樣的自由能計(jì)算（ABF）表征了crizotinib從野生型及突變型ALK中的解離路徑。研究表明，G1202R和S1206Y會(huì)阻礙crizotinib與AL

5、K中結(jié)合通道的結(jié)合，因而導(dǎo)致crizotinib的結(jié)合通路耐藥性。對(duì)于ROS1體系，我們使用了更為先進(jìn)的加強(qiáng)采樣自由能算法（funnel-based metadynamics和 absolute binding free energycalculation based on umbrella sampling）表征了crizotinib對(duì)ROS1激酶結(jié)合/解離過(guò)程的二維勢(shì)能面。發(fā)現(xiàn)與野生型ROS1激酶相比，G2032R突變體中P-loo

6、p區(qū)域的開(kāi)口幅度更大，其直接導(dǎo)致 crizotinib在突變型 ROS1結(jié)合口袋中的保留時(shí)間（residence time）顯著下降，因而導(dǎo)致強(qiáng)烈的耐藥性。
　　最后，我們分析了遺傳病相關(guān)的靶標(biāo)突變對(duì)小分子結(jié)合的影響，并提出了化學(xué)藥物治療遺傳病的治療策略。其原理在于“獲得功能性”或“喪失功能性”遺傳病的治療可以通過(guò)使用其對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)的拮抗劑（antagonist）或激動(dòng)劑（agonist）來(lái)抑制或激活其功能。然而，這種化學(xué)療法必須滿足

7、一個(gè)前提，即這些“獲得功能性”或“喪失功能性”的靶標(biāo)突變并不會(huì)對(duì)化學(xué)藥物的結(jié)合產(chǎn)生不良影響。因此我們利用分子對(duì)接和 MM/GBSA自由能重打分的方法評(píng)測(cè)了已知成功藥物靶標(biāo)的遺傳病相關(guān)突變位點(diǎn)對(duì)上市藥物結(jié)合能力的影響。研究發(fā)現(xiàn)，在多數(shù)情況下這些疾病相關(guān)突變位點(diǎn)并不會(huì)對(duì)藥物的結(jié)合產(chǎn)生不良影響。與此同時(shí)，我們也注意到在我們所統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)中已有20~50％的化學(xué)藥物已在不同種類的遺傳病中得到試驗(yàn)和應(yīng)用，因此以上分析支持使用化學(xué)藥物對(duì)遺傳疾病進(jìn)行治療