棉花促絲裂原活化蛋白激酶基因GhMPK11的分離及生物學(xué)功能分析.pdf

1、促絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase, MAPK）是真核生物中普遍存在的一類蘇氨酸/酪氨酸雙重特異性蛋白激酶，位于MAPK級聯(lián)信號途徑的最下游，可以直接作用于下游靶基因，引起體內(nèi)的生理生化變化。MAPK級聯(lián)信號途徑廣泛參與植物的生長發(fā)育、非生物脅迫響應(yīng)（干旱、高鹽、低溫等）以及生物脅迫響應(yīng)（病蟲害）等，因此研究MAPK在逆境脅迫下的功能對植物適應(yīng)逆境脅迫有重要意義。但是目前對MAPK的研

2、究仍然主要集中在模式植物，在農(nóng)作物中的研究較少。而且對MAPK基因的研究主要集中在MPK3、MPK4和MPK6，其他基因研究較少。棉花是我國重要的經(jīng)濟(jì)作物，對棉花中MAPK基因抗逆功能的研究，有助于幫助棉花更好地適應(yīng)逆境脅迫，具有重要的經(jīng)濟(jì)價值和社會效益。本文以陸地棉為研究材料，分離克隆到一個新的基因GhMPK11，并對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析和功能分析，具體結(jié)果如下：
　?。?）GhMPK11的cDNA序列全長為1274bp，包含1

3、36bp的5'非編碼區(qū)、1098bp的開放閱讀框（ORF）和40bp的3'非編碼區(qū)。ORF編碼一個含有365個氨基酸的多肽，預(yù)測其分子量約為42kDa，pI值為6.44。基因組結(jié)構(gòu)比較、氨基酸同源比對以及系統(tǒng)發(fā)育樹分析表明GhMPK11基因?qū)儆贐組的MAPK，另外利用基因槍法和農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時轉(zhuǎn)化法確定GhMPK11定位在細(xì)胞核中。
　　（2）對GhMPK11基因的表達(dá)特性進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)過氧化氫（hydrogen peroxi

4、de, H2O2）、植物激素脫落酸（abscissic acid, ABA）、赤霉素（gibberellic acid, GA）、青枯病菌和立氏絲核真菌可以不同程度地誘導(dǎo) GhMPK11的表達(dá)。因此我們初步推測GhMPK11參與信號分子途徑和植物對病原菌的響應(yīng)。
　?。?）GhMPK11啟動子序列分析發(fā)現(xiàn)一些抗性相關(guān)元件、生長發(fā)育相關(guān)元件和GA相關(guān)元件等。GUS染色實驗結(jié)果表明，GA3可以增強(qiáng)轉(zhuǎn)啟動子擬南芥植株的GUS活性，進(jìn)一步

5、說明GhMPK11參與GA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。
　?。?）采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法轉(zhuǎn)化本生煙，獲得了超表達(dá)GhMPK11的煙草植株和轉(zhuǎn)空載體的煙草植株（對照植株）并對它們進(jìn)行PCR鑒定。觀察再生植株的生長過程發(fā)現(xiàn)，超表達(dá)GhMPK11的煙草植株葉片存在失綠的現(xiàn)象；而且GhMPK11的轉(zhuǎn)基因植株中含有較高的GA3含量和較高的GA相關(guān)基因表達(dá)量，說明GhMPK11可以通過調(diào)節(jié)GA相關(guān)基因的表達(dá)改變GA3含量。
　?。?）轉(zhuǎn)基因植株的抗病

6、性實驗說明，超表達(dá)GhMPK11可以降低轉(zhuǎn)基因植株對青枯病菌和立氏絲核真菌的抗性，增強(qiáng)感病葉片中活性氧（reactive oxygen species, ROS）的積累，這意味著GhMPK11參與調(diào)節(jié)體內(nèi)ROS的變化以及生物脅迫響應(yīng)。
　?。?）分析感病前后葉片中GA、水楊酸（salicylic acid, SA）以及茉莉酸（jasmonic acid, JA）相關(guān)基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)病原菌處理后GA相關(guān)基因的表達(dá)存在顯著性差異變化，

7、初步斷定GhMPK11通過GA信號途徑參與植物對病原菌的響應(yīng)。
　?。?）病原菌侵染離體葉片的同時進(jìn)行外施GA3處理，結(jié)果表明外源GA3可以抵消內(nèi)源GA3對植株抗病性的影響并增強(qiáng)植株對病原菌的敏感性。結(jié)合之前的結(jié)果，說明GhMPK11通過GA信號途徑來調(diào)節(jié)抗病反應(yīng)。
　　（8）測定病原菌處理后ROS相關(guān)基因的表達(dá)和抗氧化酶的酶活，發(fā)現(xiàn)與對照植株相比，超表達(dá)GhMPK11的煙草植株中呼吸暴發(fā)氧化酶基因（ respiratory