二甲雙胍通過降低miR-34a抵抗心肌缺血再灌注損傷.pdf

1、心肌缺血再灌注損傷是急性心肌梗死病人進行溶栓或經(jīng)皮冠狀動脈介入治療（Percutanious coronary intervention，PCI）之后心肌損傷的重要原因，是血管再次開通引起的心肌繼發(fā)損傷，目前尚無有效的緩解辦法。雖然缺血后適應法被認為有一定的緩解作用，但操作復雜，可控性差，仍不能完全避免再灌注損傷。因此，研究探討緩解心肌缺血再灌注損傷的有效方法有重要的臨床應用意義。
　　心肌缺血再灌注損傷涉及心肌細胞炎癥反應、氧化

2、應激、線粒體損傷、自噬、凋亡等方面，但其具體分子機制仍未研究清楚。
　　microRNA作為一種廣泛表達于所有組織和個體各個發(fā)展階段，調(diào)節(jié)各種生理病理過程的功能性小分子，也參與了心血管疾病如心肌肥大，心衰、心肌梗死等的調(diào)節(jié)過程。凋亡是microRNA的一個常見的調(diào)控過程。研究顯示，促凋亡的p53蛋白在轉(zhuǎn)錄水平直接上調(diào)miR-34a的表達；抑制凋亡的Bcl-2的mRNA是miR-34a的靶分子。在腫瘤細胞中，p53能夠通過增加miR

3、-34a的表達而降低Bcl-2的表達，進而增加腫瘤細胞的凋亡，起到抗腫瘤的作用。然而，我們前期研究發(fā)現(xiàn)，大鼠心肌細胞株H9C2經(jīng)氧糖剝奪再灌注（模擬缺血再灌注）損傷后，細胞中miR-34a水平明顯增加。此時增加的miR-34a是否也與引起心肌缺血再灌注損傷的凋亡有關(guān)？未見報道。
　　二甲雙胍是國際用藥指南推薦的安全性高、副反應較少治療2型糖尿病的一線口服藥物。除了通過抑制肝糖異生和葡萄糖釋放起到降低血糖的作用外，還能夠:
　

4、　（1）通過調(diào)節(jié)microRNA的表達對腫瘤起到抑制作用。例如，二甲雙胍增加Let-7表達抑制乳腺癌，增加miR-26a抑制胰腺癌等；
　?。?）對心血管有保護作用例如，二甲雙胍可以降低所2型糖尿病患者全原因死亡率、心梗發(fā)生率；減少心?；颊吆蛯嶒瀯游镄募」Ｋ赖拿娣e與血清心肌酶水平；促進梗死后心肌的重塑。二甲雙胍是否也對心肌的缺血再灌注損傷有保護作用？如有保護作用，其保護機制如何？是否與其促凋亡而抑制腫瘤的機制相反，是通過降低miR

5、-34a抑制凋亡而實現(xiàn)的？未見報道。
　　為了探討上述問題，本文分別以實驗動物，心肌細胞和臨床標本為對象，進行以下三部分研究：
　　（1）二甲雙胍對大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護作用；
　　（2）二甲雙胍對大鼠H9C2心肌細胞氧糖剝奪再灌注損傷的保護作用及其機制研究；
　　（3）二甲雙胍對急性心肌梗死后行經(jīng)皮冠狀動脈介入治療的糖尿病患者心肌的保護作用。
　　第一部分：二甲雙胍對大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護作用

6、
　　目的：
　?。?）探討miR-34a在心肌缺血再灌注損傷中的作用；
　?。?）二甲雙胍是否對缺血再灌注損傷有保護？是否與miR-34a關(guān)聯(lián)？
　　方法：
　　1.通過結(jié)扎冠狀動脈左前降支（Left anterior descending，LAD）再開通建立大鼠/小鼠心肌缺血再灌注損傷模型。
　　2.通過心肌TTC及Evans’藍染色、心電圖、蘇木精-伊紅(HE)染色血清心肌酶測定，觀察心肌損傷。

7、
　　3.通過心肌組織石蠟切片TUNEL染色檢測細胞凋亡發(fā)生；RT-qPCR檢測凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、p53的mRNA表達水平；western blot檢測凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、p53、caspase3和cleaved caspase3的蛋白表達水平。
　　4.進行相關(guān)性分析，證明本實驗條件下心肌缺血再灌注損傷是否與凋亡的發(fā)生相關(guān)；心肌細胞的凋亡是否又與miR-34a的增加關(guān)聯(lián)。
　　5.大鼠心肌缺血之后，于開通血

8、管再灌注的同時頸靜脈給予二甲雙胍（3 mg/kg），用上述方法和指標，觀察二甲雙胍是否降低了心肌miR-34a的水平、減少了心肌細胞凋亡和心肌損傷。
　　結(jié)果：
　　1.成功建立大鼠/小鼠心肌缺血再灌注損傷模型
　　SD大鼠及C57BL/6J小鼠心肌缺血再灌注后，在LAD供血處心肌出現(xiàn)白色梗死區(qū)域；大鼠心電圖的ST段抬高，血清心肌酶明顯增加（P<0.05）；大鼠LAD供血處心肌組織的肌纖維排列不規(guī)則，紋理模糊，出現(xiàn)多處

9、纖維溶解、斷裂，肌漿凝聚深染。結(jié)果表明，心肌缺血再灌注損傷模型建立。
　　2.心肌缺血再灌注損傷與心肌細胞凋亡增加有關(guān)
　　TUNEL染色結(jié)果顯示鼠心肌缺血再灌注損傷后，凋亡的心肌細胞比例增加了近十倍（P<0.01）。心肌細胞中抑制凋亡的Bcl-2及促凋亡的p53的mRNA及蛋白表達水平分別降低和增加（P<0.01）；凋亡的執(zhí)行蛋白Caspase3的活化形式Cleaved caspase3增加。結(jié)果說明，缺血再灌注損傷后心肌

10、細胞凋亡增加。血清CK-MB水平與凋亡細胞的比例有較強的正相關(guān)（r=0.8657，P<0.01）。說明心肌損傷與心肌細胞的凋亡有關(guān)。
　　3.心肌缺血再灌注引起的細胞凋亡與miR-34a水平增加有關(guān)
　　心肌缺血再灌注損傷后，不僅心肌的miRNA-34a水平升高（P<0.05），而且，增加的miR-34a的水平與其下游靶基因，抑制凋亡的Bcl-2的mRNA水平有一定的負相關(guān)（r=-0.499，P<0.01），與其上游的調(diào)控蛋

11、白，促凋亡的p53的蛋白水平和凋亡的細胞比例（r=0.5024，P<0.01）有較強的正相關(guān)（r=0.7599，P<0.01）。結(jié)果說明，缺血再灌注損傷后，細胞可能通過增加p53的表達上調(diào)miR-34a表達，進而下調(diào)miR-34a的下游靶基因Bcl-2的表達，增加凋亡。
　　4.二甲雙胍可減少心肌細胞凋亡，減少心肌缺血再灌注損傷
　　二甲雙胍可劑量依賴性地減少SD大鼠缺血再灌損傷的心肌梗死面積（P<0.05），減輕心肌纖維的

12、不規(guī)則排列，降低血清心肌酶的活性（P<0.05），減少細胞凋亡的比例（P<0.01）。與此同時，二甲雙胍也降低了miR-34a的表達，上調(diào)了抑制凋亡的Bcl-2、下調(diào)促凋亡的p53的mRNA與蛋白表達水平，減少cleaved caspase3的蛋白水平，（P<0.05）。結(jié)果表明，二甲雙胍可通過降低細胞的凋亡而保護缺血再灌心肌，這一保護作用可能與下調(diào)miR-34a有關(guān)。
　　小結(jié)：
　　1.心肌缺血再灌注后，伴隨miR-34

13、a的增加，心肌細胞的凋亡增加，導致了心肌功能損傷；
　　2.二甲雙胍可下調(diào)miR-34a，減少心肌細胞的凋亡而改善心肌缺血再灌注損傷。
　　第二部分：二甲雙胍抵抗大鼠H9C2心肌細胞氧糖剝奪再灌注損傷的作用及其機制
　　目的：
　　證明二甲雙胍通過下調(diào)miR-34a而減輕心肌細胞凋亡，并探討其機制
　　方法：
　　1.通過氧糖剝奪再灌注的方法，使H9C2心肌細胞受到類似整體的缺血再灌注損傷（氧糖剝奪6

14、 h、再灌注2 h）。
　　2.用TUNEL染色和流式細胞儀檢測心肌細胞發(fā)生凋亡的比例；用RT-qPCR檢測細胞內(nèi)miR-34a、Bcl-2的mRNA表達水平；用Western blot檢測凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、caspase3及其活化形式cleaved caspase3的蛋白水平。
　　3.將miR-34a mimic與inhibitor分別轉(zhuǎn)染入H9C2細胞內(nèi)過表達或敲低miR-34a后，觀察不同轉(zhuǎn)染時間或不同轉(zhuǎn)染濃度

15、條件下上述指標的改變。
　　4.氧糖剝奪后再灌注的同時，給予二甲雙胍處理，用MTS法確定二甲雙胍的濃度，觀察二甲雙胍對細胞內(nèi)pre-miR-34a、miRNA34a、p53 mRNA的表達水平，caspase3及其活化形式、Bcl-2、 p53和SIRT1的蛋白表達水平，以及SIRT1去乙?；富钚宰兓挠绊憽?br>　　結(jié)果：
　　1.氧糖剝奪再灌注使H9C2大鼠心肌細胞受到類似心肌缺血再灌注損傷：
　　a.H9C2

16、凋亡細胞比例明顯增加（P<0.001）；b.伴隨miR-34a水平增加，凋亡相關(guān)的Bcl-2 mRNA和蛋白水平下降，Cleaved Caspase3的蛋白水平增加（P<0.01）。結(jié)果表明，氧糖剝奪再灌注在H9C2細胞中模擬了心肌缺血再灌注的損傷。
　　2.氧糖剝奪再灌注（OGD/R）引起的細胞凋亡與miR-34a水平的增加有關(guān)
　　TUNEL染色顯示，分別用mimic和inhibitor過表達或敲低miR-34a后，H9

17、C2細胞的凋亡數(shù)，Bcl-2的mRNA及蛋白水平能夠隨之劑量和時間依賴性的增加或減少（P<0.001），凋亡相關(guān)蛋白Cleaved Caspase3水平降低或增加（P<0.01）。說明miR-34a水平的增加確實可導致H9C2細胞的凋亡，與氧糖剝奪再灌注下心肌細胞凋亡有關(guān)。
　　3.二甲雙胍對H9C2發(fā)生氧糖剝奪再灌注損傷有抵抗作用。
　　二甲雙胍使OGD/R細胞的凋亡比例較減少；敲低miR-34a時可以達到類似二甲雙胍的治

18、療效果，如果同時給予二甲雙胍則可使凋亡相關(guān)蛋白表達下降的更明顯。
　　4.二甲雙胍降低p53的表達和乙?；?，下調(diào)miR-34a的表達
　　在氧糖剝奪再灌注條件下，二甲雙胍雖對低表達的去乙?；窼IRT1蛋白水平?jīng)]影響，但使心肌細胞下降的SIRT1活性明顯上升，Ac-p53（Acetyl K381)的水平降低，p53的表達水平下降，以及pre-miR-34a的表達水平下調(diào)。
　　小結(jié)：
　　1.在氧糖剝奪再灌注

19、條件下，miR-34a表達上調(diào)是H9C2心肌細胞發(fā)生凋亡的原因之一。
　　2.二甲雙胍不僅下調(diào)了p53的表達，還通過上調(diào)去乙?；窼IRT1的活性減少了轉(zhuǎn)錄活性的Ac-p53量，進而下調(diào)了miR-34a的表達。
　　第三部分：二甲雙胍對糖尿病患者急性心肌梗死后行經(jīng)皮冠狀動脈介入損傷的抵抗作用
　　目的：
　　探討患者心肌缺血再灌注損傷與血清miR-34a的關(guān)系以及二甲雙的影響
　　方法：
　　1.隨機

20、選取急性ST段抬高的心肌梗死后行PCI的病人90例，檢測PCI術(shù)前術(shù)后靜脈血中心肌酶CKMB活性，以及miRNA34a水平，行術(shù)前和術(shù)后90 min標準12導聯(lián)心電圖檢測，人工測量所有導聯(lián)的ST段相對于基線的抬高值，將各導聯(lián)抬高值相加后即為ST段升高值總和。
　　2.選出術(shù)前心梗位置（V1-V6導聯(lián)ST段抬高）和程度（V1-V6導聯(lián)ST段抬高值總和）相同的患者，分成四組：
　?。?）在發(fā)病前只服用二甲雙胍的患者;
　　

21、（2）只服用他汀類藥物的患者;
　?。?）同時服用二甲雙胍與他汀類藥物的患者;
　?。?）這兩種藥物均不服用的患者。分析miRNA34a水平，與相應ST段升高值總和及CKMB水平的相關(guān)性。
　　結(jié)果：
　　1.PCI術(shù)后患者ST段升高總值下降。表明，術(shù)后心功能改善。
　　2.PCI術(shù)后患者CKMB活性升高。表明，術(shù)后有心肌缺血再灌注損傷。
　　3.PCI術(shù)后患者血清miR-34a升高，并與CKMB活性

22、正相關(guān)（r=0.4557，P<0.01）,與術(shù)前與術(shù)后ST段升高值總和之差負相關(guān)。（r=-3404，P<0.001）。表明，miR-34a與心肌缺血再灌注損傷相關(guān)。
　　4.服用二甲雙胍組患者的miR-34a水平除了與同時服用二甲雙胍和他汀藥物的患者無區(qū)別（P=0.3965>0.05）外，均低于單服用他汀類藥物（P<0.001），服用其他糖尿病治療藥物（P<0.05），以及服用其他非糖尿病治療藥物（P<0.05）三組的患者。表明，

23、二甲雙胍可降低心肌缺血再灌注導致的miR-34a水平增加。
　　小結(jié)：
　　心肌梗死患者行PCI術(shù)前術(shù)后體內(nèi)血清miR-34a水平與心肌損傷相關(guān)。二甲雙胍通過影響miR-34a表達水平對心肌缺血再灌注損傷有保護作用。
　　結(jié)論：
　　1.心肌缺血再灌注后會發(fā)生心肌損傷，此過程與心肌細胞凋亡增加相關(guān)，而凋亡增加是與miR-34a相關(guān)的。二甲雙胍可通過下調(diào)p53蛋白表達進而降低miRNA34a的表達，使其下游靶基因B

24、cl-2的mRNA及蛋白表達水平降低，最終引起凋亡蛋白Caspase3及其活化形式減少，表現(xiàn)為心肌細胞凋亡發(fā)生減少。
　　2.二甲雙胍通過上調(diào)去乙?；窼IRT1的活性，減少p53在mRNA和蛋白上的表達水平；而p53作為miR-34a的上游調(diào)控蛋白，當它的表達下調(diào)時，miR-34a的表達也就相應下調(diào)，進而減少了缺血再灌注損傷引起的細胞凋亡。
　　3.心肌梗死患者行PCI術(shù)前術(shù)后體內(nèi)血清miR-34a水平與心肌損傷相關(guān)。二甲