二甲雙胍對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞相關(guān)炎癥因子及凋亡的影響.pdf

1、研究背景
　　目前全球范圍內(nèi)2型糖尿病患病率高、致殘率高，其病因和發(fā)病機(jī)制尚未闡明。相關(guān)研究表明，2型糖尿病不僅是一種代謝性疾病，也是一種自然免疫和亞臨床炎癥疾病，其發(fā)病機(jī)制與慢性低度炎癥密切相關(guān)。而促炎因子IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α與胰島素抵抗和代謝綜合征密切相關(guān)，是糖尿病及其慢性并發(fā)癥的重要發(fā)病基礎(chǔ)，因此控制與疾病相關(guān)的炎癥因子將有著重要的臨床價(jià)值。近年來(lái)越來(lái)越多的研究表明，二甲雙胍（Metformin，Met

2、）作為臨床治療2型糖尿病的一線用藥，不僅可以降糖、降脂、減輕體重、增加胰島素敏感性，其亦具有一定的抗炎、抗氧化作用。然而，目前學(xué)者們主要致力于從體內(nèi)角度研究Met的抗炎作用，其作用機(jī)制是通過(guò)控制血糖、血脂、體重綜合作用的結(jié)果，還是其具有直接抗炎作用尚未明確，因此，關(guān)于Met的抗炎作用尚缺乏相應(yīng)的體外實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　目的
　　通過(guò)體外觀察Met對(duì)LPS誘導(dǎo)的人單核細(xì)胞（THP-1）相關(guān)炎癥因子表達(dá)及凋亡影響的劑量-效應(yīng)關(guān)系，探

3、討Met的直接抗炎作用。
　　方法
　　①實(shí)驗(yàn)對(duì)象
　　以人單核細(xì)胞系THP-1細(xì)胞為研究對(duì)象，常規(guī)培養(yǎng)在含有10％胎牛血清的RPMI1640中，培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2的濕潤(rùn)無(wú)菌環(huán)境。
　　②實(shí)驗(yàn)分組
　　A：不同濃度Met對(duì)THP-1細(xì)胞存活率的影響
　?。?）對(duì)照組：培養(yǎng)基對(duì)照；
　?。?）Met實(shí)驗(yàn)組：設(shè)置Met實(shí)驗(yàn)濃度分別為0.1mmol/L、1mmol/L、5mmol/L、10m

4、mol/L、20mmol/L共5組；
　　B：Met對(duì)LPS誘導(dǎo)下THP-1細(xì)胞相關(guān)炎癥因子及凋亡的影響
　　（1）對(duì)照組：培養(yǎng)基對(duì)照；
　?。?）LPS組：含1μg/mLLPS的完全培養(yǎng)基；
　　（3）Met實(shí)驗(yàn)組：LPS組+Met（0.1mmol/L、1mmol/L、5mmol/L）；以上各組分別培養(yǎng)6h、24h、48h后收集細(xì)胞及培養(yǎng)基上清。
　?、蹖?shí)驗(yàn)方法
　?。?）臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)，判斷細(xì)胞存

5、活率。
　?。?）LDH微量釋放法檢測(cè)細(xì)胞活力。
　?。?）ELISA法檢測(cè)IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α等炎性因子的分泌情況。
　?。?）AnnexinV/PI雙染色法測(cè)定細(xì)胞早期凋亡率。
　　結(jié)果
　　①體外培養(yǎng)THP-1細(xì)胞存活率：鏡下計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，THP-1活細(xì)胞比例均在95%以上，提示細(xì)胞狀態(tài)良好。
　　②不同濃度Met對(duì)THP-1細(xì)胞的存活率的影響：當(dāng)Met濃度小于5mmol/

6、L時(shí)，THP-1細(xì)胞6h、24h、48h存活率均在90％以上，與對(duì)照組相比無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P均>0.05）。當(dāng)繼續(xù)增加Met濃度至10mmol/L時(shí)，THP-1細(xì)胞48hLDH的釋放率>10%，而當(dāng)Met濃度增加至20mmol/L時(shí)，THP-1細(xì)胞24h、48hLDH的釋放率均>10%，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均<0.01）。
　?、鄄煌瑵舛萂et對(duì)LPS誘導(dǎo)下THP-1細(xì)胞相關(guān)炎性因子的影響：未受LPS作用的THP-1

7、細(xì)胞僅能分泌較低水平的IL-1β，IL-6，IL-8和TNF-α，而在LPS刺激作用下，上述炎癥因子水平顯著升高。當(dāng)作用6h時(shí)，與LPS組相比，僅發(fā)現(xiàn)5mmol/LMet+LPS組TNF-α的分泌顯著下降（P<0.05）。當(dāng)作用24h時(shí)，與LPS組相比，1mmol/LMet+LPS組IL-8分泌均顯著下降（P<0.05），而5mmol/LMet+LPS組IL-1β，IL-6，IL-8和TNF-α的分泌均顯著下降（P分別<0.05，<0.

8、01，<0.01，<0.01）。而作用48h時(shí)，1mmol/LMet+LPS組IL-1β，IL-6，IL-8和TNF-α的分泌顯著低于LPS組（P分別<0.01，<0.05，<0.05，<0.01）；5mmol/LMet+LPS組IL-1β，IL-6，IL-8和TNF-α的分泌顯亦著低于LPS組（P分別<0.001，<0.01，<0.01，<0.001）。
　?、懿煌瑵舛萂et對(duì)LPS誘導(dǎo)下THP-1細(xì)胞早期凋亡率的影響：Met可

9、劑量依賴(lài)性地減少THP-1細(xì)胞早期凋亡數(shù)目，且48h時(shí)最為顯著。單因素方差分析結(jié)果顯示，各組間有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=4.696，P=0.036)；LPS組、Met0.1、1、5mmol/L+LPS組細(xì)胞早期凋亡率分別為：49.90%、42.92%、37.47%、33.35%。與LPS組相比，1、5mmol/L+LPS組早期凋亡率降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P分別<0.05，<0.01）。
　　結(jié)論
　　Met可在一定范圍內(nèi)降低L