巨噬細(xì)胞PPARγ對(duì)皮膚傷口愈合的作用研究.pdf

1、皮膚是人體最大的器官，具有抵御冷熱刺激，阻止病原體入侵等重要人體保護(hù)功能。由于皮膚常常暴露在外界環(huán)境中，極易損傷。皮膚損傷后，機(jī)體啟動(dòng)修復(fù)維持皮膚自身穩(wěn)態(tài)，恢復(fù)其完整結(jié)構(gòu)和正常功能。皮膚傷口愈合是一個(gè)由免疫細(xì)胞，角質(zhì)上皮細(xì)胞，成纖維細(xì)胞，血管內(nèi)皮細(xì)胞，細(xì)胞外基質(zhì)，細(xì)胞因子以及生長(zhǎng)因子等多細(xì)胞多介質(zhì)共同參與，多階段有序進(jìn)行的復(fù)雜生理過(guò)程?？梢苑譃榻M織炎癥期，組織生成期和組織塑形期。正因?yàn)槠つw傷口愈合的復(fù)雜性，愈合進(jìn)程極易受自身?xiàng)l件和外界環(huán)

2、境的干擾而出現(xiàn)障礙，遺留下慢性難愈傷口。了解正常皮膚傷口愈合的調(diào)控機(jī)制可以為臨床治療慢性難愈傷口提供理論依據(jù)。
　　巨噬細(xì)胞是調(diào)控皮膚傷口愈合的關(guān)鍵細(xì)胞。巨噬細(xì)胞分泌促炎癥因子促進(jìn)傷口炎癥反應(yīng)，分泌蛋白酶和活性氧自由基抵抗病原體，分泌抗炎癥因子和吞噬凋亡細(xì)胞促進(jìn)傷口炎癥消退，以及分泌細(xì)胞因子，生長(zhǎng)因子和趨化因子等作用于角質(zhì)上皮細(xì)胞，成纖維細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞促進(jìn)傷口上皮再生，膠原沉積和血管生成[11]。在傷口愈合中，巨噬細(xì)胞趨化障礙

3、，吞噬凋亡細(xì)胞功能受損，極化異常等都將導(dǎo)致傷口遷延不愈。因此，維持傷口巨噬細(xì)胞正常功能對(duì)傷口愈合至關(guān)重要。目前，對(duì)傷口巨噬細(xì)胞功能的調(diào)控機(jī)制還不清楚。
　　核轉(zhuǎn)錄因子過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體（Peroxisome proliferator activated receptorγ,PPARγ）是調(diào)控巨噬細(xì)胞功能的重要分子。PPARγ可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞吞噬凋亡細(xì)胞并使巨噬細(xì)胞從促炎癥狀態(tài)轉(zhuǎn)化為抗炎癥狀態(tài)，進(jìn)而促進(jìn)炎癥消退。提示PPAR

4、γ在皮膚傷口愈合中對(duì)巨噬細(xì)胞可能具有一定的調(diào)控作用。我們的研究在于明確巨噬細(xì)胞PPARγ在皮膚傷口愈合中的作用及機(jī)制。
　　在本研究中，我們首先檢測(cè)了野生型（Wild type,WT）小鼠傷口愈合過(guò)程中傷口組織以及傷口巨噬細(xì)胞PPARγ的表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)皮膚損傷后組織和巨噬細(xì)胞PPARγ表達(dá)上調(diào)，提示組織和巨噬細(xì)胞PPARγ對(duì)傷口愈合具有調(diào)節(jié)作用。然后我們采用LoxP-Cre系統(tǒng)構(gòu)建了特異敲除巨噬細(xì)胞PPARγ（PPARγ-KO）小

5、鼠，同時(shí)將基因組含有LoxP位點(diǎn)但不含Cre酶（無(wú)巨噬細(xì)胞PPARγ敲除，PPARγ-WT）的小鼠作為對(duì)照。我們研究發(fā)現(xiàn)，PPARγ-KO小鼠傷口愈合明顯延遲，傷口肉芽組織生成，膠原沉積和血管生成減少。我們進(jìn)一步探究 PPARγ-KO小鼠傷口愈合延遲的原因。因?yàn)檠装Y細(xì)胞在傷口的正常浸潤(rùn)對(duì)傷口愈合至關(guān)重要，我們?cè)赑PARγ-WT和PPARγ-KO小鼠傷口中檢測(cè)了中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的數(shù)目，發(fā)現(xiàn)沒有明顯差異，提示巨噬細(xì)胞 PPARγ敲除不影

6、響傷口炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。除炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)外，炎癥因子在傷口愈合中也具有重要作用。文獻(xiàn)報(bào)道傷口TNF-α過(guò)度表達(dá)嚴(yán)重?fù)p害愈合過(guò)程。我們研究發(fā)現(xiàn)PPARγ-KO傷口TNF-α表達(dá)明顯增多，并且在PPARγ-KO傷口注射抗小鼠TNF-α拮抗劑（Anti-mouse TNF-α,aTNF-α）后傷口愈合明顯加快，肉芽組織生成，膠原沉積和血管生成也明顯增加。由于巨噬細(xì)胞是傷口組織細(xì)胞因子的主要來(lái)源，我們檢測(cè)了PPARγ-KO傷口巨噬細(xì)胞TNF-α表達(dá)后

7、發(fā)現(xiàn)其表達(dá)明顯增加。這些結(jié)果說(shuō)明PPARγ-KO傷口TNF-α過(guò)多表達(dá)是其愈合障礙的關(guān)鍵因素，并且PPARγ-KO巨噬細(xì)胞分泌的過(guò)多TNF-α促使了傷口TNF-α表達(dá)過(guò)多。
　　我們進(jìn)一步研究了PPARγ缺陷引起巨噬細(xì)胞分泌過(guò)多TNF-α的內(nèi)在機(jī)制。在體外實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)，PPARγ-WT和PPARγ-KO在靜息狀態(tài)下都低表達(dá)TNF-α。在脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）刺激下，TNF-α表達(dá)明顯增多但兩者間沒

8、有差異，說(shuō)明PPARγ對(duì)巨噬細(xì)胞分泌TNF-α沒有直接調(diào)控作用。然而，在LPS刺激下加入凋亡胸腺細(xì)胞（Apoptotic thymocytes,ATs）后PPARγ-WT巨噬細(xì)胞TNF-α表達(dá)明顯減少，而PPARγ-KO巨噬細(xì)胞TNF-α表達(dá)并沒有減少，由于巨噬細(xì)胞吞噬凋亡細(xì)胞后TNF-α表達(dá)會(huì)減少，因此提示PPARγ-KO巨噬細(xì)胞吞噬凋亡細(xì)胞功能障礙。在LPS，ATs和細(xì)胞松弛素B（Actin-filament polymerisat

9、ion-blocking agent cytochalasin B）共同孵育下，PPARγ-WT和PPARγ-KO巨噬細(xì)胞都持續(xù)高表達(dá)TNF-α，說(shuō)明TNF-α表達(dá)減少確由吞噬引起，并且巨噬細(xì)胞吞噬二醋酸羧基熒光素（CFSE）標(biāo)記ATs實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明了PPARγ-KO巨噬細(xì)胞吞噬率下降。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)PPARγ-KO傷口凋亡細(xì)胞聚集，沒有得到及時(shí)有效的吞噬清除。這些結(jié)果證實(shí)了PPARγ缺陷導(dǎo)致巨噬細(xì)胞吞噬凋亡細(xì)胞功能障礙。巨噬細(xì)

10、胞吞噬功能與其吞噬相關(guān)受體和調(diào)理素（Opsonin）直接相關(guān)，我們檢測(cè)了PPARγ-WT和PPARγ-KO巨噬細(xì)胞吞噬受體CD36，Mertk以及調(diào)理素Mfge8，Gas-6，C1qa，C1qb和C1qc的表達(dá)，結(jié)果表明PPARγ-KO巨噬細(xì)胞其吞噬相關(guān)分子表達(dá)下降，提示PPARγ缺陷將下調(diào)巨噬細(xì)胞吞噬相關(guān)分子的表達(dá)。由此證明，PPARγ通過(guò)調(diào)控巨噬細(xì)胞的吞噬相關(guān)分子表達(dá)影響其吞噬功能。
　　最后，我們用PPARγ特異激動(dòng)劑羅格列