黃芪主要成份對(duì)免疫抑制復(fù)合皮膚傷口愈合及成纖維細(xì)胞作用的研究.pdf

1、黃芪，"乃瘡家之圣藥"，具有補(bǔ)氣而托毒生肌，利水消腫，益衛(wèi)固表等功效。在臨床上治療氣血不足，瘡瘍內(nèi)陷的膿成不潰或潰久不斂的慢性傷口。在創(chuàng)傷愈合過(guò)程中細(xì)胞的增殖和膠原代謝失常起著至關(guān)重要的作用。創(chuàng)面內(nèi)膠原合成能力降低和膠原分解過(guò)度，成為創(chuàng)面難愈合的重要原因。臨床和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均證明中藥合理運(yùn)用治療慢性皮膚潰瘍療效顯著。為研究黃芪對(duì)創(chuàng)傷愈合作用和其可能的機(jī)理，本論文以免疫抑制復(fù)合皮膚傷口(immunosuPPressive and skin w

2、ound，ISW)模型和體外培養(yǎng)NIH3T3成纖維細(xì)胞為對(duì)象，觀察內(nèi)服黃芪水煎劑和外敷黃芪多糖(Astragalus Polysaccharin，APS)對(duì)創(chuàng)面的愈合作用；黃芪多糖和黃芪甲苷(AstragalosideⅣ)對(duì)細(xì)胞增殖和膠原代謝的調(diào)節(jié)作用，為中醫(yī)外科治療慢性愈合皮膚創(chuàng)面的治則、遣方用藥提供科學(xué)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 論文研究分為以下兩部分進(jìn)行： 1整體實(shí)驗(yàn) 1.1制備氫化可的松免疫抑制復(fù)合皮膚傷口的動(dòng)物模型

3、 虛寒性創(chuàng)面模型的探索本文首先制備免疫抑制復(fù)合皮膚傷口的動(dòng)物模型。以氫化可的松處理小鼠造成免疫抑制狀態(tài)，用特制打孔器打一均勻的圓孔，采取全層皮切除術(shù)，制作小鼠免疫抑制復(fù)合皮膚傷口。觀察小鼠創(chuàng)傷前后一般情況并動(dòng)態(tài)測(cè)定傷口面積愈合率。于創(chuàng)傷后3d、7d取傷口組織經(jīng)HE和天狼猩紅染色觀察組織學(xué)變化。結(jié)果顯示：(1)肌肉注射氫化可的松7天后，模型組小鼠一般情況較差，出現(xiàn)體重下降、毛色無(wú)光澤、萎靡不振、弓背少動(dòng)、反應(yīng)遲鈍、并且有畏寒等現(xiàn)象。正

4、常組小鼠一般情況良好，無(wú)以上癥狀。復(fù)合皮膚傷口后，模型組小鼠以上癥狀加重，眼睜不開，相互之間嘶咬，甚至少數(shù)死亡。(2)致創(chuàng)3天后，對(duì)照組與模型組傷口面積愈合率無(wú)明顯差異，在致創(chuàng)7天時(shí)，模型組傷口面積明顯大于對(duì)照組(P<0.05)，對(duì)照組傷口愈合率明顯高于模型組。(3)鏡下觀察：創(chuàng)傷后第3d，HE染色觀察對(duì)照組傷口有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，模型組小鼠創(chuàng)面炎癥細(xì)胞較稀疏，天狼猩紅染色對(duì)照組可見少量呈黃色的Ⅰ型膠原和呈綠色的Ⅲ型膠原，模型組Ⅲ型膠原

5、要明顯少于對(duì)照組；創(chuàng)傷后第7d，HE染色觀察對(duì)照組周邊炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，有肉芽組織出現(xiàn)。對(duì)照組和模型組Ⅰ型和Ⅲ膠原均增多，模型組呈綠色的Ⅲ型膠原少于對(duì)照組。結(jié)果提示：注射氫化可的松后小鼠處于免疫抑制狀態(tài)，皮膚損傷后仍處于免疫抑制狀態(tài)，創(chuàng)面愈合延遲，屬于虛寒性創(chuàng)面模型。 1.2黃芪水煎劑對(duì)免疫抑制復(fù)合皮膚傷口小鼠創(chuàng)面的愈合作用 本實(shí)驗(yàn)選取40只Bal/c小鼠，隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、高劑量(293.12×10<'-3>g/mL

6、)、中劑量(146.56×10<'-3>g/mL)、低劑量(73.28×10<'-3>g/mL)五組，在免疫抑制的基礎(chǔ)上復(fù)合皮膚傷口，每隔2d測(cè)量小鼠的傷口面積，直至傷口愈合。結(jié)果表明，在造模當(dāng)天致創(chuàng)后，統(tǒng)計(jì)分析各組創(chuàng)面面積愈合率無(wú)明顯差異；創(chuàng)傷3天時(shí)，對(duì)照組和模型組的傷口愈合率之間統(tǒng)計(jì)學(xué)比較未見明顯差異；在創(chuàng)傷6天時(shí)，對(duì)照組傷口面積愈合率明顯大于模型組(P<0.01)。對(duì)照組的傷口面積要明顯小于模型組，高劑量組與模型組比較(P<0.0

7、1)，中劑量組與模型組比較(P<0.05)，低劑量組與模型組比較(P<0.01)；創(chuàng)傷9天時(shí)，對(duì)照組與模型組比較(P<0.01)，中劑量組與模型組比較(P<0.01)；創(chuàng)傷12天時(shí)，高中低劑量組與模型組比較均(P<0.05)。鏡下觀察：對(duì)照組創(chuàng)面愈合時(shí)，模型組創(chuàng)面有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，黃芪水煎劑高劑量組、中劑量組、低劑量組創(chuàng)面可見新生毛細(xì)血管及成纖維細(xì)胞，和新生表皮形成，以高劑量尤為明顯。 1.3外用黃芪多糖對(duì)免疫抑制復(fù)合皮肽傷口小

8、鼠創(chuàng)面的愈合作用 本實(shí)驗(yàn)選取40只Balb/c小鼠，隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、高劑量(0.8g/L)、中劑量(0.4g/L)、低劑量(0.2g/L)五組，每隔2d測(cè)量小鼠的傷口面積，直至傷口愈合。結(jié)果表明：在致創(chuàng)當(dāng)天，統(tǒng)計(jì)分析各組創(chuàng)面面積無(wú)明顯差異；創(chuàng)傷3天時(shí)，各組之間傷口愈合率比較沒(méi)有明顯差異；創(chuàng)傷6天時(shí)，對(duì)照組傷口面積愈合率明顯大于模型組(P<0.05)，中劑量組與模型組之間比較(P<0.05)；創(chuàng)傷9天時(shí)，對(duì)照組與模型組之間

9、比較(P<0.05)，中劑量組與模型組之問(wèn)比較(P<0.05)；創(chuàng)傷12天后，對(duì)照組與模型組之間比較(P<0.05)，中劑量組與模型組之間比較(P<0.01)，高劑量組與模型組(P<0.05)。綜上所述，創(chuàng)傷6d以后，對(duì)照組的傷口面積要明顯小于模型組，愈合率要高于模型組，中級(jí)量組的愈合率要高于模型組，中劑量愈合速度最快，高劑量組在12d愈合率也高于模型組?？梢缘贸鐾庥命S芪多糖對(duì)Balb/c小鼠傷口愈合是具有促進(jìn)作用的。HE染色時(shí)對(duì)照組創(chuàng)

10、面愈合時(shí)有血管形成；模型組有少許炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；黃芪多糖高劑量有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，能見角化層；中劑量愈合時(shí)，表皮結(jié)構(gòu)已基本形成，有大量炎性細(xì)胞。 2體外實(shí)驗(yàn) 2.1 APS和黃芪甲苷對(duì)NIH3T3小鼠成纖維細(xì)胞增殖和遷移的影響 本實(shí)驗(yàn)以NH3T3為細(xì)胞模型，分為陽(yáng)性藥組、對(duì)照組、APS不同濃度組，每組10個(gè)復(fù)孔。作用48h后采用MTT法觀察APS對(duì)NIH3T3小鼠成纖維細(xì)胞增殖的作用。黃芪多糖濃度在9.75μg/mL～

11、19.5μg/mL間對(duì)3T3小鼠成纖維細(xì)胞有明顯的促增殖作用(P<0.01)，APS濃度在19.5μg/ml的增殖率達(dá)到顛峰，為23.06％；但APS大于1.56μg/mL對(duì)NIH3T3細(xì)胞有明顯的抑制作用(P<0.001)。在作用24h，在19.5μg/mL-78μg/mL濃度范圍內(nèi)對(duì)3T3小鼠成纖維細(xì)胞有促增殖作用(P<0.05)，APS濃度在39μg/ml的增殖率作用最為明顯，為27.06％，高濃度沒(méi)有表現(xiàn)出抑制作用。作用72h，

12、在所選的濃度范圍內(nèi)沒(méi)有表現(xiàn)明顯的增殖作用；但在312μg/ml，對(duì)細(xì)胞呈現(xiàn)明顯的抑制作用，與對(duì)照組相比(P<0.001)。細(xì)胞遷移結(jié)果顯示APS能促進(jìn)較多的NIH3T3細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞創(chuàng)口，分別與對(duì)照組有極顯著差異(P<0.01)，bFGF組愈合速度最快，與同時(shí)相的APS組相比亦有極顯著差異(P<0.01)。上述結(jié)果表明APS濃度對(duì)成纖維細(xì)胞的增殖有一定的量效關(guān)系，提示我們?cè)谂R床上使用黃芪治療慢性皮膚潰瘍或慢性愈合皮膚創(chuàng)面用藥時(shí)要注意藥物的

13、時(shí)間和劑量。 2.2黃芪甲苷對(duì)NIH3T3小鼠成纖維細(xì)胞增殖作用 本實(shí)驗(yàn)以NIH3T3為細(xì)胞模型，用MTT法檢測(cè)加藥48h時(shí)，黃芪甲苷對(duì)3T3成纖維細(xì)胞增殖在濃度為20μg/mL和10μg/mL時(shí)，黃芪甲苷組的OD值均高于相對(duì)應(yīng)的DMSO對(duì)照組，但是之間沒(méi)有顯著性差異。作用72h時(shí)，在濃度為20 μg/mL時(shí)，黃芪甲苷組的OD值明顯高于對(duì)應(yīng)的DMSO對(duì)照組(P<0.05)，在濃度為10 μg/mL和5 μ g/mL時(shí)，黃

14、芪甲苷組的OD值均高于相對(duì)應(yīng)的DMSO對(duì)照組。綜合48h和72h的結(jié)果來(lái)看，時(shí)間延長(zhǎng)黃芪甲苷對(duì)3T3增殖有加強(qiáng)的趨勢(shì)，隨著濃度增加增殖作用在增強(qiáng)。 2．3黃芪多糖和黃芪甲苷對(duì)膠原合成的影響 本實(shí)驗(yàn)以NIH3T3為細(xì)胞模型，用羥脯氨酸試劑盒測(cè)量黃芪多糖對(duì)NIH3T3細(xì)胞膠原合成作用的影響。加藥48小時(shí)，2．44μg/mL～9．75 μg/mL濃度范圍內(nèi)對(duì)膠原蛋白合成具有促進(jìn)作用，與細(xì)胞對(duì)照組比較差異顯著(P<0．05)。

15、黃芪甲苷對(duì)3T3細(xì)胞膠原合成的濃度效應(yīng)在濃度為20μg/mL時(shí)，黃芪甲苷組的OD值高于相對(duì)應(yīng)的DMSO對(duì)照組(P<0.05)在濃度為10 μg/mL和5 μg/mL時(shí)，黃芪甲苷組的OD值高于對(duì)應(yīng)的DMSO對(duì)照組，但運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析之間沒(méi)有顯著差異。綜合上述結(jié)果可以得知黃芪甲苷影響3T3細(xì)胞膠原合成。 本論文是首先制備小鼠免疫抑制復(fù)合皮膚傷口的動(dòng)物模型，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示：免疫抑制復(fù)合皮膚傷口模型符合虛寒性創(chuàng)面模