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文檔簡介
1、研究背景及目的:肥胖已經(jīng)成為一種影響成年人和兒童的全球流行性疾病,流行病學(xué)的研究表明,過多的身體脂肪影響女性生殖功能,可導(dǎo)致女性月經(jīng)紊亂、不排卵和不育。但是肥胖影響女性生殖功能的機(jī)制還不清楚。已有研究證實(shí),CR可以延長各種動物的壽命,也使哺乳動物的卵巢壽命延長,但CR延長卵巢壽命的機(jī)制也還不十分清楚。近期研究表明,mTOR信號在肥胖及其相關(guān)疾病中發(fā)揮著重要作用;而SIRT家族是調(diào)控CR延長動物生命的重要因子,SIRT1轉(zhuǎn)基因小鼠壽命延長
2、,卵泡發(fā)育受到抑制,性成熟推遲。提示mTOR和SIRT1信號可能參與調(diào)控卵巢發(fā)育。本研究以成年Sprague Dawley(SD)雌性大鼠為研究對象,用高脂食物喂養(yǎng)和能量限制方法建立肥胖和能量限制大鼠模型,旨在研究肥胖與能量限制對成年雌性大鼠卵巢壽命和卵泡發(fā)育的影響及其作用機(jī)制。
材料與方法:36只成年雌性SD(Sprague Dawley)大鼠隨機(jī)分為對照(NC)組(自由取食標(biāo)準(zhǔn)的動物飼料),高脂(High-fat,HF)組
3、(自由取食添加了20%豬油的標(biāo)準(zhǔn)飼料),能量限制(Calorie Restriction,CR)組攝食NC組70%的飼料。每只大鼠單籠飼養(yǎng),自由取水。每天早上對大鼠實(shí)施陰道涂片觀察大鼠動情周期并記錄大鼠的進(jìn)食量。連續(xù)喂養(yǎng)18周后,按0.3mg/100g體重的劑量腹腔注射戊巴比妥鈉,將大鼠麻醉后用頸椎脫臼法處死大鼠。剖開腹腔,取各組大鼠的腎周脂肪及雙側(cè)卵巢并稱重。蘇木素-伊紅(hematoxylin-eoxin,HE)染色觀察并分別計(jì)數(shù)5
4、張有代表性的組織切片中各級卵泡數(shù)以及各級卵泡數(shù)占總卵泡數(shù)的比例。通過免疫組化來觀察mTOR信號和SIRT1信號中各因子在卵巢各類卵泡細(xì)胞中的表達(dá)與定位。通過Western blot來檢測卵巢中mTOR信號和SIRT1信號中各因子,如mTORC1,p-S6K1,SIRT1,SIRT6,FOXO3a和NRF-1的蛋白表達(dá)水平。
結(jié)果:在飲食處理期間,NC組的攝入量為16.6±0.1g/d,攝入能量為65.2±0.7kcal;CR組
5、攝入量為12.1±0.1g/d,攝入能量為47.2±0.3kcal;HF組的攝入量為14.8±0.2g/d,攝入能量為86.2±0.8kcal。盡管HF組的攝入量比NC組少,但HF組大鼠攝入的能量比NC組大鼠多。飲食處理18周后,HF食物致大鼠中度肥胖,HF組大鼠質(zhì)量、內(nèi)臟脂肪和卵巢質(zhì)量均高于NC和CR組(P<0.05)。HE染色結(jié)果顯示,與NC組比,HF組、CR組的存活卵泡數(shù)(128.9±2.7,138.9±1.2vs.124.6±1
6、.4;P>0.05,P<0.05)和黃體數(shù)(36.1±1.4,28.6±1.5vs.20.5±1.8;P<0.05,P>0.05)較多,但是HF組原始卵泡數(shù)(22.1±0.7)及比例(10.3±0.2%)相對于對照組(43.6±0.6,23.0±0.2%)明顯減少,發(fā)育中卵泡數(shù)(106.8±2.5vs.81.0±1.8;P<0.01)和閉鎖卵泡數(shù)(79.2±0.9vs.63.6±1.0;P<0.01)增多,提示肥胖可以加速卵泡發(fā)育與消耗
7、,從而加快了卵泡的損失。而CR組原始卵泡數(shù)(62.8±1.4vs.43.6±0.6;P<0.001)及比例(32.7±0.4%vs.23.0±0.2%,P<0.01)顯著增加,閉鎖卵泡數(shù)(53.2±0.9vs.63.6±1.0;P<0.05)及比例(27.4±0.3%vs.33.7±0.3%;P<0.01)減少,提示能量限制可以降低卵泡的損耗。免疫組化的結(jié)果表明,mTOR信號和SIRT1信號中的各因子均在大鼠卵巢卵泡中表達(dá)。Wester
8、n blot結(jié)果顯示,與NC大鼠相比,HF組大鼠卵巢中mTORC1和p-S6K1的蛋白表達(dá)水平顯著增高,而SIRT1,SIRT6,Foxo3a和NRF-1的蛋白表達(dá)量降低;另外,CR大鼠卵巢中mTORC1和p-S6K1的蛋白表達(dá)低于NC組,而SIRT1,SIRT6,Foxo3a和NRF-1的蛋白表達(dá)高于NC組,且差異均具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這些結(jié)果提示高能量攝入或肥胖可激活大鼠卵巢中mTOR信號,抑制SIRT1信號;而CR抑制mTOR信號,激活
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