炎癥應(yīng)激通過激活mTOR通路誘導(dǎo)THP-1巨噬細(xì)胞泡沫化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：研究炎癥介質(zhì)-脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的炎癥應(yīng)激是否通過激活mTOR通路，增加SCAP/SREBP2表達(dá)，干擾SCAP/SREBP2負(fù)反饋調(diào)控，增加THP-1巨噬細(xì)胞對非修飾低密度脂蛋白膽固醇(LDL)攝取，導(dǎo)致泡沫細(xì)胞形成。
　　方法：⑴誘導(dǎo)分化成功的THP-1源性巨噬細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)4h后，分為對照組(5ug/ml LDL)，炎癥刺激組（5ug/ml LDL+200ng/ml LPS），炎癥+雷帕霉素組（5ug/ml

2、LDL+200ng/ml LPS+10ng/ml Rapamycin），以上各組細(xì)胞培養(yǎng)24h后收獲。⑵油紅O染色法檢測細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積情況。⑶Real-time PCR法檢測LDLr、SREBP2、SCAP、S6K1和mTOR mRNA水平。⑷Western blot法檢測LDLr、S6K1、和mTOR蛋白表達(dá)。⑸激光共聚焦法檢測SCAP在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與高爾基體間的轉(zhuǎn)位情況。⑹統(tǒng)計(jì):統(tǒng)計(jì)軟件SPSS20.0，數(shù)據(jù)表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±

3、SD）。采用t檢驗(yàn)分析兩組差異，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：①油紅O染色發(fā)現(xiàn)，炎癥應(yīng)激增加THP-1巨噬細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積，雷帕霉素抑制炎癥應(yīng)激誘導(dǎo)的脂質(zhì)聚積。②THP-1巨噬細(xì)胞LDLr mRNA變化:對照組、炎癥刺激組、炎癥+雷帕霉素組LDLr mRNA的表達(dá)分別為1、1.82±0.35和0.33±0.14。炎癥刺激組與對照組比較，LDLr mRNA顯著上調(diào)(P＜0.05);炎癥+雷帕霉素與炎癥刺激組比較，LDL

4、r mRNA表達(dá)下調(diào)(P＜0.05)。③THP-1巨噬細(xì)胞SREBP2 mRNA變化:對照組、炎癥刺激組、炎癥+雷帕霉素組SREBP2 mRNA的表達(dá)分別為1、2.21±0.35和0.33±0.21。炎癥刺激組與對照組比較，SREBP2 mRNA顯著上調(diào)（P＜0.05）;炎癥+雷帕霉素與炎癥刺激組比較，SREBP2mRNA表達(dá)下調(diào)(P＜0.05)。④THP-1巨噬細(xì)胞SCAP mRNA變化:對照組、炎癥刺激組、炎癥+雷帕霉素組SCAP

5、mRNA的表達(dá)分別為1、2.15±0.48和0.61±0.33。炎癥刺激組與對照組比較，SCAP顯著上調(diào)(P＜0.05);炎癥+雷帕霉素與炎癥刺激組比較，SCAP表達(dá)下調(diào)(P＜0.05)。⑤THP-1巨噬細(xì)胞S6K1 mRNA變化:對照組、炎癥刺激組、炎癥+雷帕霉素組S6K1 mRNA的表達(dá)分別為1、1.26±0.22和0.8±0.5。炎癥刺激組與對照組比較，S6K1 mRNA顯著上調(diào)（P＜0.05）;炎癥+雷帕霉素與炎癥刺激組比較，S

6、6K1 mRNA表達(dá)下調(diào)(P＜0.05)。⑥THP-1巨噬細(xì)胞mTOR mRNA變化:對照組、炎癥刺激組、炎癥+雷帕霉素組mTOR mRNA的表達(dá)分別為1、1.38±0.7和0.3±0.7。炎癥刺激組與對照組比較，mTOR mRNA顯著上調(diào)(P＜0.05);炎癥+雷帕霉素與炎癥刺激組比較，mTOR mRNA表達(dá)下調(diào)（P＜0.05）。⑦THP-1巨噬細(xì)胞LDLr蛋白變化:炎癥刺激組與對照組比較，LDLr蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(P＜0.05);炎

7、癥+雷帕霉素與炎癥刺激組比較，LDLr蛋白表達(dá)下調(diào)(P＜0.05)。⑧THP-1巨噬細(xì)胞S6K1蛋白變化:炎癥刺激組與對照組比較，S6k1蛋白表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.05）;炎癥+雷帕霉素與炎癥刺激組比較，S6k1蛋白表達(dá)下調(diào)(P＜0.05)。⑨THP-1巨噬細(xì)胞mTOR蛋白變化:炎癥刺激組與對照組比較，mTOR蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(P＜0.05);炎癥+雷帕霉素與炎癥刺激組比較，mTOR蛋白表達(dá)下調(diào)(P＜0.05)。10、激光共聚焦檢測發(fā)現(xiàn)

8、，炎癥應(yīng)激增加SCAP/SREBP2復(fù)合物從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)位到高爾基體，雷帕霉素則抑制炎癥應(yīng)激誘導(dǎo)的SCAP/SREBP2復(fù)合物從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)位到高爾基體。
　　結(jié)論：⑴炎癥應(yīng)激通過激活mTOR通路，上調(diào)SCAP/SREBP2表達(dá)，致SCAP/SREBP2復(fù)合體轉(zhuǎn)位至高爾基體異常增加，LDLr表達(dá)上調(diào)，致膽固醇聚積于細(xì)胞內(nèi)，泡沫細(xì)胞形成。⑵雷帕霉素能夠逆轉(zhuǎn)炎癥應(yīng)激誘導(dǎo)mTOR通路激活，減少細(xì)胞內(nèi)膽固醇沉積，提示炎癥應(yīng)激狀態(tài)下mTOR可能是泡