葉酸競爭抑制ELISA檢測方法的建立.pdf

1、葉酸屬B族維生素一員，是細胞分裂和維持細胞活性的重要組分，具有輔助轉(zhuǎn)運一碳單位的功能。葉酸缺乏是誘發(fā)巨幼紅細胞貧血、神經(jīng)管畸形、先天性心臟缺陷和某些心血管疾病的重要危險因素。因此建立快速、便捷、準確的葉酸水平檢測方法，對于提高全民健康水平、開展優(yōu)生優(yōu)育以及葉酸強化產(chǎn)品的市場監(jiān)管，均有著重要的意義。
　　本課題通過碳二亞胺法，將葉酸和牛血清白蛋白、雞卵清白蛋白分別偶聯(lián)合成了葉酸免疫原(FA-BSA、FA-BSA-ACA)和包被原(F

2、A-OVA)，蛋白濃度分別為12.59mg/mL、10.8mg/mL、9.71mg/mL。經(jīng)紫外掃描進行了效果鑒定，并利用OPA法測得偶聯(lián)比分別為13.16∶1、8.90∶1和4.22∶1。
　　使用FA-BSA與佐劑乳化后皮下注射的方法免疫小鼠，四次免疫后測定效價為1∶60000，間接競爭試驗的IC50為0.695μg/mL;抗體效價和性能均優(yōu)于FA-BSA-ACA的免疫結(jié)果。因此取FA-BSA免疫后的小鼠脾細胞與培養(yǎng)的SP2/

3、0細胞進行融合試驗，融合后7天獲得了能夠生長的雜交瘤細胞，兩周后進行ELISA試驗檢測上清，共有60孔陽性。將陽性孔內(nèi)細胞進行有限稀釋，最終檢測上清無明顯變化，考慮可能為雜交瘸細胞分泌抗體功能丟失。
　　利用FA-BSA免疫家兔制備多克隆抗體，家兔血清效價為1∶128000，間接競爭試驗的IC50為59.91μg/mL。采用親和層析純化兔血清中抗葉酸的多克隆抗體，經(jīng)BCA法定量蛋白濃度為0.63mg/mL，并在此基礎上使用棋盤法確

4、認最適抗原抗體工作條件，包被濃度為2μg/mL，多抗?jié)舛葹?.27μg/mL，二抗最適稀釋度為1∶2000。
　　在純化抗體的基礎上建立葉酸間接ELISA檢測方法并制作標準曲線，其方程為Y=-0.4924X+0.3819，R2值為0.993，IC50為5.965μg/mL。回收率在83.333％-98.627％之間，批內(nèi)變異系數(shù)在5.677％-8.553％之間，批間變異系數(shù)在5.217％-9.392％之間，對比未純化的抗體檢測效果