己烯雌酚人工抗原的制備和間接競爭ELISA檢測方法的建立.pdf

1、己烯雌酚( diethylstibestrol，DES)是一種人工合成的雌激素。在養(yǎng)殖業(yè)中，DES作為一種動物生長促進劑在提高動物日增重和減少脂肪等方面效果明顯，但DES有致癌和致畸作用，世界各國均規(guī)定動物及動物性食品中不得檢出DES。酶聯(lián)免疫吸附分析法(ELISA)簡便快速、靈敏度高，是DES應(yīng)用監(jiān)控的一種重要手段。目前國內(nèi)關(guān)于DES的ELISA檢測方法的研究大多是基于國外研究的基礎(chǔ)上，且用于檢測的ELISA試劑盒仍以國外的為主。本研

2、究是為研制具有我國自主知識產(chǎn)權(quán)的DES殘留免疫檢測試劑盒奠定基礎(chǔ)，主要對DES衍生物制備、DES人工抗原合成、DES多克隆抗體抗制備及ELISA檢測方法等進行了研究：
　　 1.己烯雌酚衍生物制備
　　 利用DES與琥珀酸酐反應(yīng)將DES的一個酚羥基酰化成羧基，從而合成了DES人工半抗原(DES-HS)，并對產(chǎn)物進行核磁共振氫譜及紅外光譜鑒定。
　　 2.己烯雌酚人工抗原的合成及鑒定
　　 采用活性酯法將D

3、ES-HS與載體蛋白牛血清白蛋白(BSA)偶聯(lián)制備免疫原(DES-BSA)，混合酸酐法與卵清蛋白(OVA)偶聯(lián)制備包被原(DES-OVA)。通過SDS-PAGE凝膠電泳、紫外掃描圖譜鑒定交聯(lián)反應(yīng)成功，用紫外光譜法計算出DES-BSA的半抗原結(jié)合比是10:1。
　　 3.多克隆抗體制備與ELISA檢測條件的優(yōu)化
　　 用人工合成的免疫原DES-BSA免疫家兔，采集免疫動物血清。對包被液、封閉液等因素進行優(yōu)化，應(yīng)用間接ELI

4、SA法檢測抗血清的效價為64000倍。用抗血清來建立檢測DES的Ci-ELISA法時，通過方陣實驗確定了包被抗原(DES-OVA)的工作濃度是1.25ug/ml，抗血清的工作濃度為1:4000稀釋。
　　 4.間接競爭酶聯(lián)免疫吸附測定法(Ci-ELISA法)的建立
　　 建立了間接競爭ELISA標準抑制曲線，回歸方程為y=-36.254x+128.43(R2=0.9854)，半數(shù)抑制量(IC50)為125.9ng/ml，